Name: cell-based assay protocol for the prognostic prediction of idiopathic scoliosis using cellular dielectric spectroscopy
Uploaded: 2013-10-16T20:00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra La Fondation Yves Cotrel de l&#39;Institut de France, Paris, Frankrig (Dr. Moreau) Den canadiske Institutes of Health Research (indrømme PP2-99466 til Dr. Moreau), og fra fjerde dimension Spine LLC , New York, USA (Research tilskud til Dr. Moreau).

Hele proceduren er udført under sterile biologiske hætte og alle løsninger og udstyr, der kommer i kontakt med celler skal være sterile. 1.. Fremstilling af grundlæggende løsninger <ol><li> Forbered løsninger i henhold til tabel 1. </li><li> Hold balanceret saltopløsning (BSS) ved stuetemperatur, og alle andre opløsninger ved 4 ° C indtil anvendelsestidspunktet. </li><li> Varm kolde medier til 37 ° C i vandbad i et par minutter, før du bruger. </li></ol> 2. Tilberedning og opbevaring af PBMC&#39;er <ol><li> Collect 10 ml fuldblod i EDTA-behandlede opsamlingsrør at forberede to portioner af PBMC&#39;er ved hjælp af 5 ml for hver prøve. </li><li> Overfør 5 ml helblod fra EDTA-behandlede opsamlingsrør til et 50 ml rør. </li><li> Læg et tilsvarende volumen BSS og blandes prøven ved forsigtig pipettering op og ned. </li><li> Anbringes 3 ml Ficoll i to 15 ml Falcon-rør. </li><li> Forsigtigt lag 4,5 mlaf fortyndet blod blandingen over Ficoll i hvert rør. </li><li> Lad rørene hvile i op til 5 minutter for at favorisere en klar adskillelse af blod og Ficoll. </li><li> Centrifuger rørene ved 400 xg i 30 minutter ved stuetemperatur uden bremse. </li><li> Fjern forsigtigt rørene fra centrifugen, så den ikke forstyrrer lagdeling. PBMC&#39;erne er synlige BSS / Ficoll-grænsefladen. </li><li> Høste overskyet lag af PBMC&#39;er ved grænsefladen mellem de to rør med en pipette og overføres til en ny 50 ml rør. </li><li> Tilsættes 20 ml komplette medier. </li><li> Centrifuger røret ved 288 g i 7 min ved stuetemperatur. </li><li> Fjern supernatanten ved aspiration. </li><li> Resuspender cellepelleten i 500 ul supplerende medier. </li><li> Tilføj en tilsvarende mængde indefrysning medier. </li><li> Overfør cellesuspension til en cryovial. </li><li> Placer cryovialet i en cryofreezing beholder med isopropanol. </li><li> Opbevar frysning beholder ved -80 ° C natten over. </li><li> Transfer de frosne PBMC&#39;er udportionerer til flydende nitrogen til langtidsopbevaring. </li></ol> 3. Funktionelt assay 1.. Dag 1 <ol><li> Placer alikvot fra flydende nitrogen i vandbad ved 37 ° C i et minut, eller indtil optøet. </li><li> Overfør cellesuspension til et 50 ml rør med en steril pipette. </li><li> Tilsættes 15 ml komplette medier og spin cellerne ned ved 200 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. </li><li> Fjern supernatanten ved aspiration. </li><li> Forsigtigt suspendere cellepelleten i 1 ml PHA medier. </li><li> Gennemfør volumen til 20 ml med samme medie. </li><li> Cap røret løst til at tillade luft at komme ind. </li><li> Lad slangen natten over ved 37 ° C i en CO 2 inkubator for at tillade hvilende lymfocytter til at transformere sig hastigt prolifererende Lymfoblaster. </li></ol> 2. Dag 2 <ol><li> Tag slangen ud af kuvøsen, skru lågene helt og spin cellerne ned ved 200 xg i 5 minved stuetemperatur. </li><li> Fjern supernatanten ved aspiration. </li><li> Forsigtigt suspendere cellepelleten i 1 ml komplette medier. </li><li> Gennemfør volumen til 20 ml med samme medie. </li><li> Cap røret løst til at tillade luft at komme ind. </li><li> Lad rør natten over ved 37 ° C i en CO2-inkubator for at udvide celleantal. </li></ol> 3. Dag 3 <ol><li> Få slangen ud af inkubatoren, screw caps fuldstændigt og spinde cellerne ned ved 200 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. </li><li> Fjern supernatanten ved aspiration. </li><li> Vask cellerne to gange med 10 ml RPMI-1640 ved centrifugering ved 200 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. </li><li> Forsigtigt resuspendere cellepelleten i 600 pi RPMI-1640. </li><li> Måling af koncentrationen af ​​cellen og levedygtighed under anvendelse af en automatiseret celletæller og levedygtighed analysatoren. </li><li> Tilføj passende volumen af RPMI-1640 til at tilpasse sig en celle koncentration på 1,5 x 10 5 cells/20 ul. </li&gt; <li> Behandle celler med rekombinant OPN (rOPN) eller vehikel (PBS) i 1,5 ml Eppendorf-rør. <ol><li> Overfør 100 ul cellesuspension til to sterile 1,5 ml Eppendorf-rør. </li><li> Tilføj rOPN i et rør til en slutkoncentration på 0,5 ug / ml. </li><li> Læg et lige volumen af ​​PBS i det andet rør. </li><li> Bland forsigtigt hver betingelse ved at pipettere op og ned to gange med en steril pipette sæt på 100 ul. </li></ol></li><li> Forbered lille prøve mikroplade med 96 brønde. <ol><li> Tilsæt 5 pi RPMI-1640 til hver brønd. </li><li> Centrifugeres pladen ved 200 x g i 3 minutter for at fjerne eventuelle luftbobler. </li></ol></li><li> Seed de ubehandlede celler samt celler behandlet med rOPN eller PBS. <ol><li> Før overførsel af celler fra røret til mikroplade pipettér forsigtigt op og ned en gang for at sikre en ensartet suspension af celler. </li><li> Tilsæt 40 ​​ul cellesuspension pr brønd i fire eksemplarer til ubehandlede celler i to eksemplarer til rOPN eller PBS-behandlede celler. Refer til figur 1 for design. Dette design giver 12 patienter at blive testet på samme mikroplade. </li><li> Forlade cellen pladen under sterile hætte i 5 minutter for at tillade celler at hvile og bundfælde sig på bunden af ​​brønden, før anbringelse i inkubatoren. </li></ol></li><li> Inkubér pladen i 18 timer ved 37 ° C i en CO2-inkubator for at optimere effekten af OPN. </li></ol> 4.. Dag 4 <ol><li> Kør pladen med forbindelser. <ol><li> Tag pladen ud af inkubatoren og lade det blive ved RT i omkring 30 minutter. </li><li> Forbered 1 ml 100 pM somatostatin og isoproterenol i RPMI-1640 ved tilsætning af 10 pi af stamopløsningen (10 mM) i 990 pi RPMI-1640. </li><li> Fyld forbindelsen pladen ved dispensering af 20 pi i passende brønde som vist i figur 2. </li><li> Dæk sammensatte plade med en forskåret gennemstikkeligt forsegling for at undgå ændringer i sammensatte koncentration på grund af fordampning føreller under inkubation i CDS-baseret system. </li><li> Vejecelle plade, pipettespidser og sammensatte plade ind i CDS-baseret system. </li><li> Navngiv pladen i CDS-baserede instrument software. </li><li> Vælg den relevante protokol. Protokollen redigeret for klassificeringen med PBMC&#39;er kaldes &quot;agonist Ikke-klæbende celler lille udsnit Plate RT 15 min&quot;. Gå til protokollen, og vælg denne protokol på listen over protokoller </li><li> Indled protokollen ved at klikke på &quot;Start&quot;. </li><li> Det integrerede fluidik-system samtidig tilføjer forbindelserne til alle brønde ved at injicere 5 pi per brønd for at opnå en slutkoncentration på 10 uM i et samlet volumen på 50 ul. </li><li> CDS-baserede system indsamler automatisk data for 15 minutter efter sammensatte tilsætning. </li></ol></li><li> Dataanalyse <ol><li> Vælg lave og høje serier af frekvenser til brug ved beregning af udtrukne værdier for ikke-adhærerende celler. </li><li> Vælg afdrift korrektion til at korrigere den lineære ændringer i baseline impedansmålinger over tid. </li><li> Vælge data filtrering for at reducere variationer i kinetisk måling respons på grund af elektronisk støj og forbindelse tilføjelse. </li><li> Vælg Max-Min metode til fuldstændig analyse tid. </li><li> Eksport af data til Excel under pladen format option. </li><li> Beregn delta G (ΔG) ved at trække gennemsnittet af svar størrelsesorden til Gi stimulation (RmGi) fra gennemsnittet af svar størrelsesorden på Gs stimulation (RmGs) efter følgende formel: ΔG = RmGi - RmGs </li><li> Procentdelen af ​​folden virkning (Fe) OPN på Gi-medieret svar ved at dividere den gennemsnitlige respons størrelsesorden Gi stimulering i nærvær af OPN (RmGiOPN) med gennemsnittet af respons størrelsesorden Gi stimulering i nærvær af PBS ( RmGiPBS) efter følgende formel: Fe = 100 x (RmGiOPN / RmGiPBS) </li><li> Se Tstand 2 til at klassificere patienter. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kane, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence:+a+call+for+a+statement+of+terms.">Prevalence: a call for a statement of terms.</a> Clin Orthop. Relat Res. 126, 43-46 (1977).</li><li>Bunnell, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+screening+for+scoliosis.">Selective screening for scoliosis.</a> Clin Orthop Relat Res. 434, 40-45 (2005).</li><li>Asher, M. A., Burton, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adolescent+idiopathic+scoliosis:+natural+history+and+long+term+treatment+effects.">Adolescent idiopathic scoliosis: natural history and long term treatment effects.</a> Scoliosis. 1 (1), 2 (2006).</li><li>Fong, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+meta-analysis+of+the+clinical+effectiveness+of+school+scoliosis+screening.">A meta-analysis of the clinical effectiveness of school scoliosis screening.</a> Spine (Phila Pa 1976). 35 (10), 1061-1071 (2010).</li><li>Chowanska, J., Kotwicki, T., Rosadzinski, K., Sliwinski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=School+screening+for+scoliosis:+can+surface+topography+replace+examination+with+scoliometer?.">School screening for scoliosis: can surface topography replace examination with scoliometer?.</a> Scoliosis. 7 (9), 1748-7161 (2012).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scoliosis+imaging:+what+radiologists+should+know.">Scoliosis imaging: what radiologists should know.</a> Radiographics. 30 (7), 1823-1842 (2010).</li><li>Wong, H. K., Hui, J. H., Rajan, U., Chia, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Idiopathic+scoliosis+in+Singapore+schoolchildren:+a+prevalence+study+15+years+into+the+screening+program.">Idiopathic scoliosis in Singapore schoolchildren: a prevalence study 15 years into the screening program.</a> Spine. 30 (10), 1188-1196 (2005).</li><li>Nachemson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+term+follow-up+study+of+non-treated+scoliosis.">A long term follow-up study of non-treated scoliosis.</a> Acta Scand. 39 (4), 466-476 (1968).</li><li>Enneking, W. F., Harrington, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+changes+in+scoliosis.">Pathological changes in scoliosis.</a> J. Joint Surg. 51 (1), 165-184 (1969).</li><li>Miller, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cause+and+natural+history+of+adolescent+idiopathic+scoliosis.">Cause and natural history of adolescent idiopathic scoliosis.</a> Orthop. Clin. North Am. 30 (3), 343-3452 (1999).</li><li>Nash, C. L., Gregg, E. C., Brown, R. H., Pillai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risks+of+exposure+to+X-rays+in+patients+undergoing+long-term+treatment+for+scoliosis.">Risks of exposure to X-rays in patients undergoing long-term treatment for scoliosis.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 61 (3), 371-400 (1979).</li><li>Akoume, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+screening+test+for+idiopathic+scoliosis+using+cellular+dielectric+spectroscopy.">Cell-based screening test for idiopathic scoliosis using cellular dielectric spectroscopy.</a> Spine. 35 (13), 601-608 (2010).</li><li>Verdonk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dielectric+spectroscopy:+a+label-free+comprehensive+platform+for+functional+evaluation+of+endogenous+receptors.">Cellular dielectric spectroscopy: a label-free comprehensive platform for functional evaluation of endogenous receptors.</a> Assay Drug Dev. Technol. 4 (5), 609-6019 (2006).</li><li>Peters, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cellular+dielectric+spectroscopy,+a+whole-cell,+label-free+technology+for+drug+discovery+on+Gi-coupled+GPCRs.">Evaluation of cellular dielectric spectroscopy, a whole-cell, label-free technology for drug discovery on Gi-coupled GPCRs.</a> J. Biomol. Screen. 12 (3), 312-319 (2007).</li><li>Peters, M. F., Scott, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+cellular+impedance+assays+for+detection+of+GPCR+pleiotropic+signaling+and+functional+selectivity.">Evaluating cellular impedance assays for detection of GPCR pleiotropic signaling and functional selectivity.</a> J. Biomol. Screen. 14 (3), 246-255 (2009).</li><li>Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+label-free+biosensors+for+pharmacological+screening+with+cell-based+functional+assays.">Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays.</a> Assay Drug Dev. Technol. 8 (2), 219-227 (2010).</li><li>Akoume, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted+Gi-coupled+receptor+signaling+occurs+in+adolescent+idiopathic+scoliosis.">Disrupted Gi-coupled receptor signaling occurs in adolescent idiopathic scoliosis.</a> J. Clin. Invest. , (2013).</li></ol>

Dette arbejde førte til flere patenter holde ved Sainte-Justine Universitetshospital og mange andre verserer i flere lande. Fjerde Dimension Spine LLC er eksklusiv licenshaver af Sainte-Justine Universitetshospital.

Vi har beskrevet en detaljeret procedure af en celle-baserede prognostiske test for idiopatisk skoliose, der gælder for perifere mononukleære blodceller (PBMC&#39;er) frisk isolerede eller bevares nedfrosset i op til et år i flydende nitrogen. Da brug frisk isolerede PBMC&#39;er er besværlig, når du tester stort antal individer, blev proceduren præsenteret med frosne PBMC&#39;er, der tilbyder en mere praktisk alternativ i kliniske omgivelser. Men problemer med celle sammenklumpning ved optøning opstod, da frosne PBMC&#39;er blev oprindeligt brugt, fører undertiden til inter-analyse variation. For at maksimere assay reproducerbarhed, anbefaler vi at undgå fryse-tø cyklus, og kun én gang ved hjælp af den frosne prøve. Fremgangsmåden er meget enkel, giver mulighed for nøjagtig påvisning af defekte Gi proteinfunktion i en kort tid. Ved hjælp af denne fremgangsmåde, kan asymptomatiske og scoliosis børn let klassificeret til bedre at forudsige deres kliniske resultat uden fare for deres helbred. HoWever, når du udfører klassificering i henhold til graden af den maksimale respons på Gi stimulation i forhold til raske kontrolpersoner 12 flere krav til kontrolpersoner bør opfyldes. Faktisk, for at have en ordentlig sammenligning kohorte, skal kontrolpersoner være alder og matches køn, ikke være på nogen form for medicin, og give private oplysninger, så som tidligere individ / familiær sygehistorie. Disse krav kan udgøre en vigtig hindring for rekruttering af kontrolpersoner. Derfor udfører klassifikation ved at undersøge graden af ​​ubalance mellem respons på Gi og Gs protein stimulation i samme individ er ideel til at fjerne nødvendigheden af ​​at bruge kontrolpersoner. Brugen af ​​CDS-baseret system til at udføre denne prognostisk test er signifikant i forhold til samtidig give Gi-og Gs-medierede cellulære reaktioner i det samme assay. Selv om mange patienter kan klassificeres med nogen ambiguity hjælp dynamikområdet er fastsat for dette assay, vil et lille antal patienter udviser værdier på grænsen af ​​intervaller, som illustreret ved resultaterne af denne rapport. At skelne disse individer har vi indført evaluering af virkningen af ​​OPN på respons på Gi stimulering ved at påvise, at OPN inducerer en differential virkning på Gi-cellulær respons blandt de tre funktionelle grupper. Faktisk fandt vi, at i nærværelse af OPN, reaktion på Gi stimulation stigninger i FG1, mens den falder i FG2 og FG3 i højere grad i FG2. På trods af den høje pris på OPN, er af afgørende betydning at anvende dette chemokin at skelne tvivlstilfælde og derfor forbedre nøjagtigheden af ​​vores klassificering assay. Men dette assay har den ulempe, at et minimum på 1,5 x 10 5 celler pr skal overholde cellulære respons med CDS-baseret system under vore eksperimentelle betingelser. Visse patientprøver vil ikke have et tilstrækkeligt antalceller, der skal testes. I dette tilfælde er det nødvendigt at minde patienterne om yderligere blodtapning, som kan være bekymrende for familier og frustrerende for de medicinske og laboratorie personale. Prospektive undersøgelser er planlagt i vores laboratorium for at løse dette problem. Ikke desto mindre er den nuværende protokol bygger på enkle og gennemprøvede metoder til at forberede celler, mens testen er automatiseret ved hjælp af en valideret etiket-fri-system 13, 14 for at overvåge cellernes svar. The test platform er relativt billigt sammenlignet med genetisk platform til rådighed for prognosen for andre sygdomme. Også udgifterne til alle de disponible materialer, herunder blodopsamlingsrør, tips, den særlige elektrode mikroplader, og koniske og Eppendorf-rør, er ikke meget dyrt og er anslået til mindre end $ 3.000 til at fuldføre en test for cirka tusind patienter. Selvom dette skøn ikke omfatter lønomkostninger til forberedelse af prøverog udførelsen af ​​de test, denne test fortsat betydeligt mere overkommelig end næste generation sekventering platforme. Bemærkelsesværdige er ikke kun udgifterne sammenlignet med genetiske platforme, men mere specifikt relateret til området for AIS, er de omkostninger, der er forbundet med radiologisk billeddannelse. I dag er mere end en million børn i USA og omkring 100.000 børn i Canada diagnosticeret med idiopatisk skoliose, og de samlede udgifter til diagnose og overvågning af de scoliosis børn ved røntgen-eksponering er over 2,5 milliarder dollars årligt i Nordamerika. Således vil vores celle-baserede assay procedure forventes at være egnet til rutinemæssig screening og overvågning af børn med idiopatisk skoliose uden sundhedsrisiko og til lavere omkostninger.

Idiopatisk skoliose er en rygrad deformitet af ukendt årsag generelt defineret som en lateral krumning større end 10 grader, ledsaget af en vertebral rotation 1. Betingelsen påvirker 4% af den pædiatriske befolkning, og er mest almindeligt diagnosticeret i alderen af 9 til 13 år 2,3,4. Diagnosen er primært for udstødelse og er lavet efter at udelukke andre årsager til spinal deformitet, såsom vertebral misdannelse, neuromuskulære eller syndromiske lidelser. Traditionelt er trunkal asymmetri afsløret af Adams fremad bøjning test og måles med scoliometer under fysisk undersøgelse 5.. Diagnosen kan derefter bekræftes ved radiografisk observation af kurven og den vinkel måling ved hjælp af Cobb-metoden 6. Når diagnosticeret, er den primære bekymring for læger i forvaltningen scoliosis børn om kurven vil fremskridt. Faktisk kurveprogressionen er ofte uforudsigelig oger observeret hyppigere blandt piger end hos drenge 7. Hvis ubehandlet, kan kurven fremskridt dramatisk, hvilket skaber en betydelig fysisk deformitet og endda kardiopulmonale problemer. Disse manifestationer blive livstruende, når kurven overstiger 70 ° 8,9. De nuværende behandlingsmuligheder for at forhindre eller standse kurveprogression omfatter skinner og kirurgi. Generelt afstivningselementer anbefales til kurver mellem 25-40 °, mens operationen er forbeholdt kurver mere end 45 ° eller ikke reagerer på afstivning. Ca. 10% af børn diagnosticeret med idiopatisk skoliose har kurveprogression kræver korrigerende kirurgi 10. I øjeblikket er der ingen dokumenteret metode eller test til rådighed til at identificere denne gruppe patienter. Derfor er alle diagnosticerede børn udsættes for flere røntgenbilleder over flere år, som regel indtil de når skelet modenhed. Det anslås, at de typiske patienter med skoliose vil havecirka 22 radiologiske undersøgelser over en 3-årig periode 11. På grund af den potentielle risiko for flere radiografiske undersøgelser, de alternative tilgange, der kan tillade udførelse af prognosen for idiopatisk skoliose uden at udsætte børn for ioniserende stråling er stærkt ønskelig. Med den hensigt at opfylde dette behov har vi tidligere udviklet en celle-baseret screening assay som en prognostisk test til hurtigere at identificere de asymptomatiske børn med risiko for at udvikle idiopatisk skoliose. Testen forudsiger det kliniske resultat i både asymptomatiske og ramte børn ved at undersøge den funktionelle status Gi proteiner og klassificere børn i tre funktionelle grupper (FG1, FG2 og FG3), i henhold til graden af den maksimale respons på Gi protein stimulation 12 målt ved CDS -baseret system. Dette system er i vid udstrækning anvendes til at vurdere signaltransduktion gennem G-proteiner i forskellige celletyper 13,14,15,16. Det giver oplysninger omsamlet integreret cellernes reaktion på eksterne stimuli ved at måle ændringer i impedans som følge af aktiveringen af ​​celleoverfladereceptorer. Cellerne podes i mikrotiterplader, der indeholder elektroder i bunden af ​​brøndene, og systemet anvender en lille spænding, der inducerer ekstracellulære og transcellulær strømme. Følgende forbindelse indsprøjtning i brønden, er celleoverfladereceptorer stimuleres og signaltransduktionsbegivenheder forekomme, hvilket fører til cellulære ændringer, der påvirker strømmen af ​​ekstracellulære og transcellulær strømme og derved påvirke den målte størrelse. Med denne fremgangsmåde, de scoliosis patienter og børn større risiko for at udvikle skoliose er mindre lydhøre over for Gi protein stimulation sammenlignet med raske kontrolpersoner, og klassificeringen er baseret på procentdelen af ​​graden af ​​reduktion i forhold til kontrolgruppen. Klassifikationstrinene intervaller er fastgjort mellem 10 og 40% for FG3, 40 og 60% for FG2, og 60 og 90% for FG1 12. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; På det seneste har vi ændret denne tilgang ved at demonstrere, at de tre funktionelle grupper tydeligt kan skelnes ifølge profilen af ​​ubalance mellem respons på Gi og Gs stimulation. Faktisk fandt vi, at reaktion på Gi stimulering dominerede i FG3, mens ingen tilsyneladende ubalance blev observeret i FG2. I modsætning hertil FG1 udstillede overvægt af respons på Gs stimulering. Desuden har vi givet beviser for, at patienter, der tilhører FG2 er mere udsatte for forløber til det punkt, at behøve kirurgi 17. Præcisionen af ​​denne klassifikation test er yderligere blevet forbedret ved at demonstrere en differentieret effekt af osteopontin (OPN) på respons på Gi stimulering blandt funktionelle grupper. Her dokumenterer vi detaljerede trin eksperimentelle og analytiske procedurer i dette funktionelle test som i øjeblikket varetages i vores laboratorium.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Wisent, Inc</td>
			<td>350-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Therno Scientific Hyclone</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Plaque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17144003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytohemagglutinin</td>
			<td>Invitrogen (Gibco)</td>
			<td>10576-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Osteopontin</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc</td>
			<td>1433-OP/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Somatostatin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Wisent, Inc</td>
			<td>311-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipette tips</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>301-06-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Eppendorf tubes</td>
			<td>Ultident</td>
			<td>24-MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellkey small sample 96W microplate</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1026496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellkey tips</td>
			<td>Cybio</td>
			<td>OL3800-25-559N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precut pierceable seals</td>
			<td>Excel Scientific, Inc</td>
			<td>XP-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicell XR</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>731050</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>1284</td>
			<td>Class II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen storage</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CY5093570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89032-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard light microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMIL LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51019557</td>
			<td>5% CO2 at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low speed centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellkey system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1019185</td>
			<td>CDS-based instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-based assay protocol for the prognostic prediction of idiopathic scoliosis using cellular dielectric spectroscopy

Denne protokol beskriver den eksperimentelle og analytiske procedure for en celle-baserede assay udviklet i vores laboratorium som en funktionel test til at forudsige prognosen for idiopatisk skoliose hos asymptomatiske og berørte børn. Analysen består af evalueringen af ​​den funktionelle status af Gi og Gs proteiner i perifere mononukleære blodceller (PBMC&#39;er) ved cellulær dielektrisk spektroskopi (CDS), ved hjælp af en automatiseret CDS-instrument, og klassificeringen af ​​børn i tre funktionelle grupper (FG1 , FG2, FG3) med hensyn til profilen af ​​ubalance mellem graden af ​​respons på Gi og Gs-proteiner stimulation. Klassificeringen bekræftes yderligere af den differentierede virkning af osteopontin (OPN) på respons på Gi stimulering blandt grupper og den alvorlige progression af sygdommen er refereres af FG2. Cirka, er et volumen på 10 ml blod der kræves for at udtrække PBMC&#39;er ved Ficoll-gradient og celler bliver derefter opbevaret i flydende nitrogen. Det passende antal PBMC&#39;er at udføre analysen opnås efter to dage med cellekultur. Grundlæggende er celler først inkuberet med phytohemmaglutinin (PHA). Efter 24 timers inkubation udskiftes mediet med et PHA-dyrkningsmedium i yderligere 24 timer før cellepodning og OPN behandling. Celler bliver derefter spektroskopisk screenet for deres svar på somatostatin og isoproterenol, som henholdsvis aktiverer Gi og Gs proteiner gennem deres beslægtede receptorer. Både somatostatin og isoproterenol samtidigt indsprøjtes med en integreret fluidik, og cellernes respons overvåges i 15 min. Assayet kan udføres med friske eller frosne PBMC&#39;er, og proceduren er afsluttet inden for 4 dage.

Cellelevedygtighed var sammenlignelig blandt alle prøver med værdier konsistente i området 86 og 96%. I modsætning hertil var høje variationer bemærket i celleantal blandt prøver (Tabel 3). Af de 32 prøver, der anvendes, to havde utilstrækkeligt antal celler og er ikke blevet klassificeret. Et eksempel på resultaterne af den funktionelle klassificering efter graden af ubalance mellem Gi og Gs signaleringen vist i figur 3.. Den lodrette akse af dette tal er opdelt i tre sektioner afgrænser de funktionelle grupper med dynamiske intervaller etableret som&gt; +10 til FG3 mellem +10 og -10 for FG2 og endelig &lt;-10 til FG1. Blandt 30 testede her patienter blev 14, 6, og 5 patienter klart klassificeret i FG3, FG2 og FG1 henholdsvis mens fem patienter, især 345, 353, 370, 371 og 382, ​​var på grænsen af ​​intervaller. Evalueringen af ​​OPN effekt på respons på Gi stimulering havde afsløret, at OPN øget respons i patienterne 353 og 371. I modsætning hertil blev reaktion reduceret med mere end 50% hos patienter 345 og 382, ​​og med mindre end 50% i patient 370 efter rOPN behandling. Så ifølge vores klassificeringskriterier (tabel 2), var vi i stand til at kategorisere patienter 353 og 371 i FG1 patienter 345 og 382 i FG2 og patient 370 i FG3. Sideløbende blev alle patienter screenet for deres reaktion på Gi-protein stimulering og i forhold til kontrolpersoner. Som forventet, alle patienter var mindre lydhøre end kontrolpersoner, og patienterne klassificeret i samme funktionelle gruppe af vores nye procedure udstillet lignende niveauer af den maksimale respons (figur 5). Desuden forskel mellem patienter i hver funktionel gruppe var i overensstemmelse med vores klassiske sortiment af klassificering 12, validering vores nye procedure. Klassificeringen af ​​en stor kohorte af scoliosis patienter regelmæssigt fulgt i vores særlige klinik på Sainte-Justine Hospital har vist, at trefunktionelle grupper blev tilsvarende fordelt mellem moderate tilfælde, mens FG2 var fremherskende blandt alvorlige tilfælde (figur 6), at identificere patienter kategoriseret i denne funktionelle gruppe som større risiko for svær progression af sygdommen, og indikerer, at denne klassificering test kan være nyttige i prognose af idiopatisk skoliose. <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="5"> Opløsning A </td><td> Vandfri D-glucose </td><td> 0,1% </td></tr><tr><td> CaCl2 2H 2 O </td><td> 0,05 mm </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 0,98 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5.4 mM </td></tr><tr><td> Tris </td><td> 145 mM </td></tr><tr><td> Opløsning B </td><td> NaCl </td><td> 140 mm </td></tr><tr><td rowspan="2"> Balanced Salt Solution (BSS) </td><td> Opløsning A </td><td> 1 rumfang </td></tr><tr><td> Opløsning B </td><td> 9 volumen </td></tr><tr><tdrowspan = &quot;3&quot;&gt; Complete medier </td><td> RPMI-1640 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Antibiotika-antimykotikum </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td rowspan="3"> Supplerende medier </td><td> RPMI-1640 </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> Antibiotika-antimykotikum </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 40% </td></tr><tr><td rowspan="4"> Frysning medier </td><td> RPMI-1640 </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> Antibiotika-antimykotikum </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 40% </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 20% </td></tr><tr><td rowspan="4"> PHA medier </td><td> RPMI-1640 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Antibiotika-antimykotikum </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Phytohemaglutinin </td><td> 1% </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Essentialløsninger. <table border="1"><tbody><tr><td> Dynamiske intervaller med ΔG </td><td> Funktionelle grupper </td><td> Dynamiske intervaller med Fe </td></tr><tr><td> ΔG &lt;-10 </td><td> FG1 </td><td> Fe&gt; 100% </td></tr><tr><td> -10 &lt;ΔG &lt;+10 </td><td> FG2 </td><td> Fe &lt;50% </td></tr><tr><td> ΔG&gt; +10 </td><td> FG3 </td><td> 50% &lt;Fe &lt;95% </td></tr></tbody></table> Tabel 2.. Kategorisering af funktionelle grupper i henhold til dynamiske områder er oprettet med ΔG og Fe. <table border="1"><tbody><tr><td> Patienter </td><td> Levedygtighed (%) </td><td> Cell-koncentration (× 10 6 / ml) </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> 343 </td><td> 88,7 </td><td> 11.64 </td><td></td></tr><tr><td> 344 </td><td> 90.5</td><td> 13.6 </td><td></td></tr><tr><td> 345 </td><td> 94.4 </td><td> 8.54 </td><td></td></tr><tr><td> 346 </td><td> 94,3 </td><td> 25.79 </td><td></td></tr><tr><td> 347 </td><td> 94,2 </td><td> 27.36 </td><td></td></tr><tr><td> 348 </td><td> 94,6 </td><td> 8.52 </td><td></td></tr><tr><td> 349 </td><td> 91,2 </td><td> 0,82 </td><td> Utilstrækkelig antal celler </td></tr><tr><td> 350 </td><td> 90,3 </td><td> 8.92 </td><td></td></tr><tr><td> 352 </td><td> 92,6 </td><td> 8.28 </td><td></td></tr><tr><td> 353 </td><td> 91,3 </td><td> 12.75 </td><td></td></tr><tr><td> 354 </td><td> 86,9 </td><td> 7.62 </td><td></td></tr><tr><td> 355 </td><td> 91,2 </td><td> 7.51 </td><td></td></tr><tr><td> 356 </td><td> 90,3 </td><td> 9.36 </td><td></td></tr><tr><td> 358 </td><td> 95.1 </td><td> 16.94 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> 359 </td><td> 92.3 </td><td> 13.89 </td><td></td></tr><tr><td> 360 </td><td> 89,4 </td><td> 7,67 </td><td></td></tr><tr><td> 361 </td><td> 93,5 </td><td> 7.84 </td><td></td></tr><tr><td> 365 </td><td> 86,5 </td><td> 2.2 </td><td> Utilstrækkelig antal celler </td></tr><tr><td> 368 </td><td> 92,6 </td><td> 15.69 </td><td></td></tr><tr><td> 369 </td><td> 93,4 </td><td> 10.9 </td><td></td></tr><tr><td> 370 </td><td> 92,5 </td><td> 19.93 </td><td></td></tr><tr><td> 371 </td><td> 88.8 </td><td> 10.68 </td><td></td></tr><tr><td> 374 </td><td> 93,9 </td><td> 16.86 </td><td></td></tr><tr><td> 376 </td><td> 92,9 </td><td> 15,67 </td><td></td></tr><tr><td> 377 </td><td> 93.1 </td><td> 9.99 </td><td></td></tr><tr><td> 378 </td><td> 93,6 </td><td> 13.57 </td><td></td></tr><tr><td> 379 &lt;/ Td&gt; <td> 92,6 </td><td> 19.86 </td><td></td></tr><tr><td> 380 </td><td> 91,1 </td><td> 8.46 </td><td></td></tr><tr><td> 381 </td><td> 93,9 </td><td> 14,82 </td><td></td></tr><tr><td> 382 </td><td> 92,1 </td><td> 23.06 </td><td></td></tr><tr><td> 383 </td><td> 92,9 </td><td> 11,82 </td><td></td></tr><tr><td> 384 </td><td> 89.1 </td><td> 7,73 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 3. Procent levedygtighed og cellekoncentration som bestemt under anvendelse af en automatiseret celletæller og levedygtighed analysatoren. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig1.jpg" /> Figur 1.. Design for celle såning. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig2.jpg" /> Figur 2.Design til afgivelse af forbindelser. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig3.jpg" /> Fig. 3. Dynamisk område af den funktionelle klassifikation ved hjælp af CDS-baseret system. Grafen illustrerer værdier for graden af ​​ubalance mellem svar på Gi og Gs stimulering opnået i PBMC&#39;er fra patienter med idiopatisk skoliose. Værdier blev målt ved CDS-baseret system som respons på 10 uM af somatostatin og isoproterenol. Hvert punkt repræsenterer ΔG begge reaktioner i duplikat. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig4.jpg" /> Fig. 4. Virkning af rOPN på respons på Gi stimulering PBMC&#39;er. Celler blev serum-udsultet i 18 timer i nærvær eller fravær af 0,5 ug / ml rOPN og derefter stimuleret med 10<html> 56 M somatostatin at indlede Gi-cellulær respons. Data i grafen blev genereret fra maksimum-minimum impedans og svarer til gennemsnittet af respons i to eksemplarer. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig5.jpg" /> Figur 5.. Funktionel status Gi protein i PBMC&#39;er fra kontrol og scoliostic emner. PBMC&#39;er fra kontrolpersonerne og scoliosis patienter blev udsat for stigende koncentrationer af somatostatin at stimulere Gi proteiner via endogen somatostatin receptor. Det cellulære respons blev målt ved CDS-baseret system, som beskrevet i proceduren sektion. Kurver blev genereret ud fra maksimum-minimum impedans. Hver kurve repræsenterer lineær regression. Data blev normaliseret til maksimal respons i celler fra kontrolpersoner og hvert punkt svarer til gennemsnittet af respons i to eksemplarer./ 50768/50768fig5large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klik her for at se større figur. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig6.jpg" /> Figur 6. Fordeling af funktionelle grupper blandt de forskellige faser af skoliose. En stor gruppe af scoliosis patienter med 794 moderat (krumninger mellem 10-44 °) og 162 alvorlige (krumning større end 45 °) sager regelmæssigt følges på Sainte-Justine Hospital, blev klassificeret efter deres grad af ubalance mellem respons på Gi og Gs stimulation. Respons blev målt ved CDS-baseret system som respons på 10 uM af somatostatin og isoproterenol.

Watch this Scientific Journal Video about Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy at JoVE.com

Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy

En struktureret protokol præsenteres for en celle-baserede assay som en funktionel test til at forudsige prognosen for idiopatisk skoliose hjælp cellulær dielektrisk spektroskopi (CDS). Assayet kan udføres med friske eller frosne perifere mononukleære blodceller (PBMC&#39;er), og proceduren er afsluttet inden for 4 dage.

Cell-baserede Assay Protokol for den prognostiske Forudsigelse af idiopatisk Skoliose Brug Cellular Dielektriske spektroskopi

This protocol details the experimental and analytical procedure for a cell-based assay developed in our laboratory as a functional test to predict the ...

Research

JoVE Journal

Medicine

An Experimental Paradigm for the Prediction of Post-Operative Pain (PPOP)

An Experimental Paradigm for the Prediction of Post-Operative Pain PPOP

Many women undergo cesarean delivery without problems, however some experience significant pain after cesarean section. Pain is associated with negative ...

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

The Trier Social Stress Test Protocol for Inducing Psychological Stress

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting.  Protocols that allow researchers to study the biological ...

Collection Protocol for Human Pancreas

Indsamling Protokol for human pancreas

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

High-throughput Flowcytometri cellebaseret assay til påvisning af antistoffer til N-methyl-D-aspartat-receptor eller dopamin-2-receptoren i humant serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

Fokus Formation: En cellebaseret assay til bestemmelse af onkogent potentiale af et gen

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

Diffus optisk spektroskopi til kvantitativ vurdering af akut ioniserende stråling induceret hudtoksicitet Brug af mus Model

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Fosfor-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: et redskab til måling<em&gt; In vivo</em&gt; Mitokondrie Oxidativ phosphorylering Kapacitet i human skeletmuskulatur

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Identifying Inhibitors of the HBx-DDB1 Interaction Using a Split Luciferase Assay System

Identificering af hæmmere af HBx-DDB1-interaktionen ved hjælp af et split luciferase-analyse system

There is an urgent need for novel therapeutic agents for hepatitis B virus (HBV) infection. Although currently available nucleos(t)ide analogs potently ...

Quantification of Optic Nerve Cross Sectional Area on MRI: A Novel Protocol using Fiji Software

Kvantificering af optisk nerve tværsnitsareal på MRI: En ny protokol ved hjælp af Fiji Software

Optic nerve assessment is an important aspect of glaucoma diagnosis and follow-up. This project describes a protocol for a unified methodology of optic ...