Name: procedure for the development of multi-depth circular cross-sectional endothelialized microchannels-on-a-chip
Uploaded: 2013-10-21T19:45:00
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Esta investigación fue parcialmente apoyado por la Fundación Nacional de Ciencia (NSF 1227359), WVU programa EPSCoR financiado por la National Science Foundation (EPS-1003907), oficina WVU ADVANCE patrocinado por la Fundación Nacional de Ciencia (1.007.978), y WVU PSCoR, respectivamente. El trabajo se realizó en microfabricación WVU compartido investigación (instalaciones para salas blancas) y Microfluidic Investigación Celular Integral de Laboratorio Chip (microchip Lab) de la Universidad de West Virginia. La imagen confocal se realizó en WVU Fondo de imágenes del microscopio.

1. La fotolitografía Fabricación de Fotoresinas Molde Maestro El siguiente protocolo muestra el proceso para la fabricación de los microcanales con diámetros entre 30-60 micras. Para obtener un microcanal con un diámetro más pequeño (menos de 30 micras), un solo giro de recubrimiento de resina fotosensible se necesita. <ol><li> Transferir la resina fotosensible reflujo de la nevera a 4 ° C para la sala limpia 24 horas antes de su uso y deje que se caliente a temperatura ambiente. <...

<html> 1. Fabricación del molde maestro Uno de los principios rectores para el diseño y la morfometría vascular se conoce como la ley de Murray 16, que establece que la distribución de los diámetros de los vasos a lo largo de la red se rige por consideraciones de energía mínimo. También establece que el cubo de los diámetros de un vaso principal en una bifurcación es igual a la suma de los cubos de los diámetros de los vasos hija ( <img alt="Ecuación 1" fo:content-width="0...

Los microvasos, como una parte del sistema de circulación, median las interacciones entre la sangre y los tejidos, apoyar las actividades metabólicas, definir microambiente del tejido, y desempeñan un papel crítico en muchas condiciones patológicas y de salud. Recapitulación de microvasos funcionales in vitro podría proporcionar una plataforma para el estudio de fenómenos vasculares complejas. Sin embargo, convencional en los ensayos de microvasos in vitro, tales como ensayos de migración de células endoteliales, ensayos de formación de tubos endoteliales, y ensayos de anillos aórticos de rata y de ratón, no son capaces de recrear la microvasos in vivo con respecto a la geometría tridimensional (3D) y de control de flujo continuo 1-8. Estudios de microvasos utilizando modelos animales y en ensayos in vivo, tales como ensayo de angiogénesis corneal, ensayo de angiogénesis de membrana corioalantoidea de pollo, y el ensayo de tapón de Matrigel, son más tiempo, alta en costo, desafiando con respecto a la observación y cuantificaciones, yplantear cuestiones éticas 1, 9-13. Los avances en la microfabricación y tecnologías de chips de microfluidos han permitido una gran variedad de conocimientos sobre ciencias biomédicas, mientras reduciendo el alto costo y la complejidad asociados con los animales de experimentación y en estudios in vivo 14, como las condiciones biológicas controladas fácilmente y firmemente y entornos fluidos dinámicos, que no tendrían sido posible con las técnicas convencionales macroescala. A continuación, presentamos un método para construir un endotelizado microcanales-on-a-chip que imita la geometría 3D de in vivo microvasos y se ejecuta bajo flujo de perfusión continua controlada mediante el uso de la combinación de la técnica de fotolitografía reflowable fotosensible, litografía blanda, y microfluidos.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent/Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflow Photoresist</td>
			<td>AZ Electronic Materials</td>
			<td>AZP4620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer</td>
			<td>AZ Electronic Materials</td>
			<td>AZ 400K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB 131 Culture Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10372-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NacBlue Nuclei Staining</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH Red Stain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MINI26 and PKH26GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHE0023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffered Saline Solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Neutralizing Solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS Curing Agent</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>14-501F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diluent C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CGLDIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst33342</td>
			<td>Invitrogen, Molecular Probes</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>95771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinner</td>
			<td>Laurell Technologies Corporation</td>
			<td>WS-400BZ-6NPP/LITE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>BelArt Products</td>
			<td>999320237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump System</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>PHD Ultra</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Biosafety Hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 Series A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planetary Centrifugal Mixer</td>
			<td>Thinky</td>
			<td>ARE-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp Oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-246-516GAQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Invertoskop 40C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>Barnstead/Thermolyne Cimarec</td>
			<td>SP131635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

procedure for the development of multi-depth circular cross-sectional endothelialized microchannels-on-a-chip

Los esfuerzos se han centrado en el desarrollo de ensayos in vitro para el estudio de microvasos porque en estudios con animales in vivo son más que consume tiempo, es caro, y la observación y cuantificación son muy desafiante. Sin embargo, convencional en los ensayos de microvasos in vitro tienen limitaciones cuando se representa en microvasos in vivo con respecto a la geometría tridimensional (3D) y proporcionar flujo de fluido continuo. Usando una combinación de la técnica de fotolitografía reflowable fotosensible, litografía blanda, y microfluidos, hemos desarrollado un multi-profundidad endotelializadas transversales circulares microcanales-on-a-chip, que imita a la geometría 3D en vivo microvasos y se ejecuta bajo perfusión continua controlada flujo. Un fotoprotector reflowable positivo se utilizó para fabricar un molde principal con una red de microcanales de sección transversal semicircular. Por la alineación y unión de los dos (PDMS) microcanales polidimetilsiloxano replicated del molde maestro, se creó una red de microcanales cilíndrica. Los diámetros de los microcanales pueden ser bien controlados. Además, las células primarias endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) sembradas dentro del chip mostraron que las células se alineaban en la superficie interior de los microcanales de acuerdo con la perfusión controlada duradera para un período de tiempo entre 4 días a 2 semanas.

Nuestro enfoque para la fabricación de la red de microcanales de múltiples profundidad imita las complejas geometrías 3D de microvasos in vivo, en el que los microcanales han redondeado las secciones transversales 15. Además, los diámetros de los canales de ramificación matrices y los canales de memoria de aproximadamente obedecen la ley de Murray para mantener el flujo de fluido a un nivel requerido para que la resistencia total del canal es baja y velocidades de flujo son más uniforme en tod...

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Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

Una plataforma de micro-canales-on-a-chip fue desarrollado por la combinación de la técnica de fotolitografía reflowable fotosensible, litografía blanda, y microfluidos. La plataforma de microcanales endotelizado imita la geometría tridimensional (3D) de microvasos in vivo, se ejecuta bajo flujo de perfusión continua controlada, permite la formación de imágenes de alta calidad y en tiempo real y se puede aplicar para la investigación microvascular.

Procedimiento para el Desarrollo de la Multi-profundidad Circular transversal endotelizado microcanales-on-a-chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, ...

Research

JoVE Journal

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