Name: preparation of primary neurons for visualizing neurites in a frozen-hydrated state using cryo-electron tomography
Uploaded: 2014-02-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography at JoVE.com

Cette recherche a été soutenue par les subventions des NIH (PN2EY016525 et P41GM103832). SHS a été soutenue par une bourse du Programme du Centre interdisciplinaire de WM Keck Bioscience formation de la Côte du Golfe consortiums (NIH Grant No. T32EB009379) de formation supérieure nanobiologie interdisciplinaire. SHS disséqué, a grandi et DRG et les cellules de l&#39;hippocampe vitrifié; recueilli cryo-EM et données cryo-ET de DRG et les axones de l&#39;hippocampe; reconstruit et couleur annoté de la série d&#39;inclinaison. MRG disséqué et fourni cellules de l&#39;hippocampe dans le laboratoire du MRN. SC assistée en série d&#39;inclinaison annotation. SHS a été formé par CW sur la façon de disséquer et de grandir neurones. SHS, WCM et WC conçus les expériences. SHS a préparé le manuscrit avec la participation d&#39;autres auteurs. Cette vidéo a été filmée au Centre d&#39;imagerie cellulaire et NanoAnalytics (C-CINA) du Biozentrum de til l&#39;Université de Bâle. C-CINA est intégré dans le Département des biosystèmes (D-BSSE) de l&#39;EPF de Zurich, situé à Bâle, en Suisse.

Une. La préparation des plats avec EM grilles pour placage neurones primaires <ol><li> Examiner l&#39;intégrité de carbone troué sur les grilles EM d&#39;or à l&#39;aide d&#39;un microscope optique à un grossissement d&#39;au moins 25X. Assurez-vous que les trous de carbone sont&gt; 98% intact. </li><li> Pour le placage neurones primaires, utiliser un brûleur Bunsen à flamme stériliser les grilles EM et en même temps rendre hydrophile. Utilisez des pinces pour ramasser la grille de EM par son bord, pas la pa...

<ol>
	<li>Al-Amoudi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitreous+sections.">Cryo-electron microscopy of vitreous sections.</a> EMBO J. 23, 3583-3588 (2004).</li><li>Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease-like+dystrophic+neurites+characteristically+associated+with+senile+plaques+are+not+found+within+other+neurodegenerative+diseases+unless+amyloid+beta-protein+deposition+is+present.">Alzheimer's disease-like dystrophic neurites characteristically associated with senile plaques are not found within other neurodegenerative diseases unless amyloid beta-protein deposition is present.</a> Brain Res. 606, 10-18 (1993).</li><li>Binks, B. 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Biol. 17, 79-84 (2007).</li><li>Medalia, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+architecture+in+eukaryotic+cells+visualized+by+cryoelectron+tomography.">Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography.</a> Science. 298, 1209-1213 (2002).</li><li>Meyerson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+molecular+structures+of+HIV+envelope+glycoproteins+using+cryo-electron+tomography+and+automated+sub-tomogram+averaging.">Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging.</a> J. Vis. Exp. (58), e2770 (2011).</li><li>Nakatomi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+Hippocampal+Pyramidal+Neurons+after+Ischemic+Brain+Injury+by+Recruitment+of+Endogenous+Neural+Progenitors.">Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors.</a> Cell. 110, 429-441 (2002).</li><li>Peachey, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Microscopic+Observations+on+the+Accumulation+of+Divalent+Cations+in+Intramitochondrial+Granules.">Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules.</a> J. Cell. Biol. 20, 95-111 (1964).</li><li>Raza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+is+associated+with+elevated+intracellular+calcium+levels+and+altered+calcium+homeostatic+mechanisms+in+hippocampal+neurons.">Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons.</a> Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).</li><li>Scroggs, R. S., Fox, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+current+variation+between+acutely+isolated+adult+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+of+different+size.">Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size.</a> J. Physiol. 445, 639-658 (1992).</li><li>Squire, L. 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Nous montrons que le rat neurones embryonnaires (ganglionnaires de la racine dorsale et l&#39;hippocampe) peuvent être cultivées en microscopie électronique or (EM) des grilles et dans la glace vitreuse suffisamment minces pour leurs neurites être imagées à l&#39;aide de 2-D cryo-EM et 3-D cryo- ET. Alors que neurites hippocampe ont déjà été imagées en utilisant cryo-ET 8,10,18,23, un protocole suffisamment détaillée pour reproduire avec succès en utilisant des dispositifs disponibles dans le co...

Les neurones établissent l&#39;essentiel des circuits complexes de la fonction des systèmes nerveux central et périphérique, par l&#39;élaboration de dendrites et des axones recevoir des informations, souvent assez volumineux, de communiquer avec des neurones en aval. L&#39;extension des neurites joue un rôle fondamental pendant le développement embryonnaire et la différenciation neuronale et la maintenance des neurites soutient de manière critique de la fonction du système nerveux. Processus séniles également critique dans les lésions neuronales et de régénération, ainsi que des troubles du système nerveux. L&#39;étude de l&#39;architecture neuronale est crucial de comprendre à la fois le cerveau normal et pathologique. Heureusement, les systèmes de culture de cellules neuronales physiologiquement pertinentes existent qui peuvent récapituler structures cellulaires complexes et hétérogènes. Basé sur l&#39;élucidation des plates-formes expérimentales solides, des stratégies de visualisation efficaces qui permettent des analyses qualitatives et quantitatives de la morphologie des neurones sont nécessaires. Particulièrement utile seraitune méthodologie détaillée qui fournit une plate-forme uniforme pour la visualisation de neurites, les axones et les dendrites à l&#39;échelle du nanomètre. Microscopie électronique traditionnelle nécessite l&#39;utilisation de solvant organique lors de la déshydratation et l&#39;incorporation de résine, ce qui peut induire des distorsions dans les spécimens de leur véritable état. À ce jour, la plupart des caractérisations structurales à l&#39;échelle du nanomètre sont basées sur des cellules plus grandes ou des tissus qui sont soumis à ces produits chimiques agressifs - limitant ainsi l&#39;interprétation des résultats 4,9,25. De plus, pour la pénétration du faisceau d&#39;électrons, le sectionnement est requis pour les organismes cellulaires ou de saillies présentant une épaisseur supérieure à 1 um 12. Enfin, en coupe ou fraisage résultats de tissus dans la collection d&#39;ensembles de données spécifiques aux tranches discrètes, ce qui rend fastidieux la définition de la fonction de forme allongée de neurites. Même pour cryo-EM, dans lequel la coupe d&#39;un échantillon congelé-hydraté est possible, la méthode présente compression artifagit 1. Au cours des dernières années, les chercheurs ont appris à cultiver des neurones d&#39;hippocampe directement sur ​​les grilles EM et le flash-gel dans les éthane liquide pour visualiser la suite neurites en utilisant cryo-ET 8,10,18,23. Toutefois, ces études utilisent soit un dispositif sur mesure 10,23, ou le manque de détails sur l&#39;étape buvard pour générer suffisamment de glace vitreuse mince pour la visualisation de routine 8,18. Par exemple, une étude recommande l&#39;utilisation de 30-40 secondes pour buvard la grille EM 10, mais cette valeur est optimisée pas pour un usage général, mais est spécifique à ce dispositif de plongée gel sur mesure. L&#39;utilisation d&#39;un dispositif sur mesure plutôt que disponible dans le commerce 17 pour maintenir l&#39;humidité avant de plonger au point de congélation de l&#39;échantillon pourrait constituer un obstacle pour la reproductibilité généralisée. Bien que ces études ont été révolutionnaire dans la visualisation de neurites par cryo-ET, nous avons franchi une nouvelle étape pour explorer l&#39;APplicability de cryo-ET à une variété de spécimens neuronales (neurones de l&#39;hippocampe et le ganglion de la racine dorsale). De plus, nous discutons de deux résultats optimaux et sous-optimaux, ainsi que les artefacts potentiels que l&#39;on peut rencontrer en utilisant cryo-ET pour ces spécimens. Définition d&#39;une technique détaillé pour la préservation et la visualisation des neurites entiers à l&#39;échelle du nanomètre dans un état quasi-native serait de renforcer la capacité pour plus de chercheurs de mener des études ultrastructurales. À cette fin, nous décrivons un protocole efficace et détaillée en utilisant un équipement disponible dans le commerce pour préparer non fixées, les neurones non colorées pour visualiser neurites. Il s&#39;agit d&#39;une première étape importante vers détaillant l&#39;ultrastructure des neurites en bonne santé et de jeter les bases pour comprendre ce que les différences structurelles sont présents dans des modèles de maladies du système nerveux. Depuis cryo-ET peut résoudre non fixées, les caractéristiques de neurites non colorées en 3-D à l&#39;échelle du nanomètre, la méthode permettant de ne jamais êtreavant de définir l&#39;architecture neuritique 12.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="970">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Dumont #7 Tweezers</td>
			<td style="width:196px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:309px;">72803-01</td>
			<td style="width:171px;">For handling EM grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek Corp.</td>
			<td>P35G-1.5-10C</td>
			<td>For growing sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electron microscopy grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Holey Carbon, Au 200, R 2/2</td>
			<td>For growing sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium-free filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1541-055</td>
			<td>For blotting sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large flat point long tweezers</td>
			<td>Excelta Corporation</td>
			<td>E003-000590, 25-SA</td>
			<td>For blotting sample </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vitrification device and tweezers</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Vitrobot Mark III</td>
			<td>For freezing sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini grid storage boxes</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>160-40</td>
			<td>For storing EM grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo transfer holder</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Semi-automated tilt series acquisition software</td>
			<td>SerialEM</td>
			<td>http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image processing software</td>
			<td>IMOD eTomo</td>
			<td>http://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
			<td>For image processing</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Transmission electron microscope for cryoEM</td>
			<td>JEOL, Tokyo</td>
			<td>200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4k x 4k CCD camera</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-D annotation software</td>
			<td>Visage Imaging GmbH</td>
			<td>Amira/Avizo</td>
			<td>For processing 3-D data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Software for digitally stitching 2-D images</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td>For processing 2-D data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-118</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B-0252</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium tetraborate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B-9876</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-lysine </td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2636-500MG</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter system</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430758</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-27 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant rat b-NGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>556-NG</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3003-5G</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5&#39;-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503-100MG</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of primary neurons for visualizing neurites in a frozen-hydrated state using cryo-electron tomography

Neurites, les dendrites et les axones, sont des processus cellulaires neuronales qui permettent la conduction des impulsions électriques entre les neurones. Définition de la structure des neurites est essentielle pour comprendre comment ces processus qui déplacent des matières et des signaux qui facilitent la communication synaptique. microscopie électronique (EM) a été traditionnellement utilisé pour évaluer les caractéristiques ultrastructurales dans neurites, mais l&#39;exposition au solvant organique lors de la déshydratation et l&#39;incorporation de résine peut fausser les structures. Un objectif important non satisfait est la formulation de procédures qui permettent des évaluations structurelles pas touchés par ces objets. Ici, nous avons établi un protocole détaillé et reproductible pour la croissance et entières neurites flash-gel des différents neurones primaires sur des grilles de microscopie électronique suivie de leur examen à la tomographie cryo-électronique (cryo-ET). Cette technique permet la visualisation en 3-D de neurites, hydratés-congelés à résolution nanométrique, facilitant assessment de leurs différences morphologiques. Notre protocole donne une vue sans précédent du ganglion de racine dorsale (DRG) neurites, et une visualisation des neurites de l&#39;hippocampe dans leur état quasi-native. En tant que tel, ces méthodes créent une fondation pour les études futures sur neurites des deux neurones normaux et ceux qui sont touchés par des troubles neurologiques.

Avant la congélation et l&#39;imagerie par cryo-ET, images au microscope optique devraient être prises de la grille de EM sur lequel les neurones sont de plus en plus. Neurites doivent être clairement visibles sans chevauchement important avec l&#39;autre. Une boîte de couleur dans la figure 3A représente une zone qui est agrandie en montrer un plus fort grossissement de la figure 3B, dans laquelle neurites s&#39;étendent à travers le treillis de la grille. Chaque grille-carré e...

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Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Afin de préserver les processus neuronaux pour l&#39;analyse ultrastructurale, nous décrivons un protocole pour le placage de neurones primaires sur des grilles de microscopie électronique suivies par la congélation instantanée, ce qui donne des échantillons en suspension dans une couche de glace vitreuse. Ces échantillons peuvent être examinés avec un microscope cryo-électronique pour visualiser les structures à l&#39;échelle nanométrique.

Préparation de neurones primaires pour visualiser Neurites à l&#39;état congelé-hydraté utilisant microscopie cryo-électronique

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Analyse quantitative des vésicules reconstitution Piscine synaptique dans des cultures de neurones granulaires du cervelet utilisant des colorants FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Recherche

Neurosciences

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Marquage fluorescent rétrograde Permet ciblée extracellulaire seule unité d&#39;enregistrement de neurones identifiés<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

Préparation d&#39;<em&gt; Drosophila</em&gt; Les neurones centraux pour<em&gt; In situ</em&gt; Patch de serrage

Short generation times and facile genetic techniques make the fruit fly Drosophila melanogaster an excellent genetic model in fundamental neuroscience ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Phosphate de calcium transfection de primaire neurones de l&#39;hippocampe

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imagerie épines dendritiques des neurones de l&#39;hippocampe de rat primaire utilisant structuré Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Culture primaire de souris dopaminergiques neurones

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Un<em&gt; In Vitro</emMuscle-nerf&gt; Adult Souris Préparation pour étudier les propriétés de cuisson des afférences musculaires

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Measuring Connectivity in the Primary Visual Pathway in Human Albinism Using Diffusion Tensor Imaging and Tractography

Mesure de la connectivité dans la voie visuelle primaire en albinisme humaine Utilisation Diffusion Tensor Imaging and Tractography

In albinism, the number of ipsilaterally projecting retinal ganglion cells (RGCs) is significantly reduced. The retina and optic chiasm have been proposed ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modélisation de la mort neuronale et la dégénérescence de neurones granules primaires de cervelet de souris

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Images en direct de la protéine GLUT4 traite des neurones hypothalamiques primaire de souris au microscope de déconvolution

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...