Name: preparation of primary neurons for visualizing neurites in a frozen-hydrated state using cryo-electron tomography
Uploaded: 2014-02-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography at JoVE.com

Diese Forschung wurde von den NIH Zuschüsse (PN2EY016525 und P41GM103832) unterstützt. SHS wurde von einem Stipendium der Nanobiologie interdisziplinäre Graduate Training Program des WM Keck Zentrum für interdisziplinäre Bioscience Ausbildung von der Golfküste Konsortien (NIH Grant No T32EB009379) unterstützt. SHS seziert, wuchs und Stein DRG und Hippocampus-Zellen; gesammelt Kryo-EM-und Kryo-ET Daten der DRG und Hippocampus Axone, rekonstruiert und Farb kommentierte den Neigungs Serie. MRG seziert und bereitgestellt Hippocampus-Zellen in MNR Labor. SC in Kippserie Annotation unterstützt. SHS wurde von CW auf, wie man zu sezieren und zu wachsen Neuronen trainiert. SHS, WCM und WC konzipiert die Experimente. SHS bereit, das Manuskript mit dem Input von anderen Autoren. Dieses Video wurde am Center for Cellular Imaging und Nanoanalytik (C-CINA) des Biozentrum t gefilmter Universität Basel. C-CINA in der Abteilung für Biosysteme (D-BSSE) der ETH Zürich, in Basel, in der Schweiz integriert.

1. Zubereitung der Speisen mit EM Grids für Überzug primären Neuronen <ol><li> Überprüfen Sie die Integrität der löchrigen Kohlenstoff auf den Gold-EM-Gitter mit einem Lichtmikroskop bei einer Vergrößerung von mindestens 25X. Stellen Sie sicher, Kohlenstoff Löcher sind&gt; 98% intakt. </li><li> Für Beschichtung primären Neuronen, verwenden Sie einen Bunsenbrenner flamm sterilisieren EM-Gitter und gleichzeitig machen sie hydrophil. Pinzette zu holen die EM Gitter am Rand, nicht das zentrale Gitterbereich. A...

<ol>
	<li>Al-Amoudi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitreous+sections.">Cryo-electron microscopy of vitreous sections.</a> EMBO J. 23, 3583-3588 (2004).</li><li>Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease-like+dystrophic+neurites+characteristically+associated+with+senile+plaques+are+not+found+within+other+neurodegenerative+diseases+unless+amyloid+beta-protein+deposition+is+present.">Alzheimer's disease-like dystrophic neurites characteristically associated with senile plaques are not found within other neurodegenerative diseases unless amyloid beta-protein deposition is present.</a> Brain Res. 606, 10-18 (1993).</li><li>Binks, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modern characterization methods of surfactant systems. , (1999).</li><li>Briggman, K. L., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+neural+circuit+reconstruction+with+volume+electron+microscopy+techniques.">Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 16, 562-570 (2006).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryotomography+of+bacterial+cells.">Electron cryotomography of bacterial cells.</a> J. Vis. Exp. (39), e1943 (2010).</li><li>DiFiglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+of+huntingtin+in+neuronal+intranuclear+inclusions+and+dystrophic+neurites+in+brain.">Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain.</a> Science. 277, 1990-1993 (1997).</li><li>Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+aqueous+suspensions.">Frozen aqueous suspensions.</a> Ultramicroscopy. 10, 55-61 (1982).</li><li>Fern&#225;ndez-Busnadiego, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+molecular+organization+of+the+neuron+by+cryo-electron+tomography.">Insights into the molecular organization of the neuron by cryo-electron tomography.</a> J. Electron Microsc. 60, 137-148 (2011).</li><li>Frey, T. G., Perkins, G. A., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+tomography+of+membrane-bound+cellular+organelles.">Electron tomography of membrane-bound cellular organelles.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 199-224 (2006).</li><li>Garvalov, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminal+particles+within+cellular+microtubules.">Luminal particles within cellular microtubules.</a> J. Cell. Biol. 174, 759-765 (2006).</li><li>Gr&#252;newald, K., Cyrklaff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+complex+viruses+and+virus-infected+cells+by+electron+cryo+tomography.">Structure of complex viruses and virus-infected cells by electron cryo tomography.</a> Curr. Opin. Microbiol. 9, 437-442 (2006).</li><li>Gu, J., Bourne, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structural bioinformatics. , (2009).</li><li>De Hoop, M. J., Meyn, L., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons+and+astrocytes+from+fetal+rodent+brain.">Culturing hippocampal neurons and astrocytes from fetal rodent brain.</a> Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, (1998).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+Block-Face+Scanning+Electron+Microscopy+to+Reconstruct+Three-Dimensional+Tissue+Nanostructure.">Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure.</a> PLoS Biol. 2, e329 (2004).</li><li>Fink, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+regulation+of+neurite+extension+and+synapse+formation+by+the+beta+but+not+the+alpha+isoform+of+CaMKII.">Selective regulation of neurite extension and synapse formation by the beta but not the alpha isoform of CaMKII.</a> Neuron. 39, 283-297 (2003).</li><li>Jacob, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+matrix+granules:+their+behavior+during+changing+metabolic+situations+and+their+relationship+to+contact+sites+between+inner+and+outer+mitochondrial+membranes.">Mitochondrial matrix granules: their behavior during changing metabolic situations and their relationship to contact sites between inner and outer mitochondrial membranes.</a> Microsc. Res. Tech. 27, 307-318 (1994).</li><li>Jensen, G. J., Briegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+electron+cryotomography+is+opening+a+new+window+onto+prokaryotic+ultrastructure.">How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).</li><li>Ibiricu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo+Electron+Tomography+of+Herpes+Simplex+Virus+during+Axonal+Transport+and+Secondary+Envelopment+in+Primary+Neurons.">Cryo Electron Tomography of Herpes Simplex Virus during Axonal Transport and Secondary Envelopment in Primary Neurons.</a> PLoS Pathog. 7, e1002406 (2011).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Koning, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo+electron+tomography+of+vitrified+fibroblasts:+microtubule+plus+ends+in+situ.">Cryo electron tomography of vitrified fibroblasts: microtubule plus ends in situ.</a> J. Struct. Biol. 161, 459-468 (2008).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).</li><li>Lotharius, J., Brundin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+Parkinson's+disease:+dopamine,+vesicles+and+alpha-synuclein.">Pathogenesis of Parkinson's disease: dopamine, vesicles and alpha-synuclein.</a> Nat. Rev. Neurosci. 3, 932-942 (2002).</li><li>Luci&#263;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+imaging+of+neurons+grown+in+culture:+from+light+microscopy+to+cryo-electron+tomography.">Multiscale imaging of neurons grown in culture: from light microscopy to cryo-electron tomography.</a> J. Struct. Biol. 160, 146 (2007).</li><li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and.">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and.</a> 2, 152-160 (2007).</li><li>Marsh, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+tomographic+studies+of+the+mammalian+Golgi.">Lessons from tomographic studies of the mammalian Golgi.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1744, 273-292 (2005).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> J. Struct. Biol. 152, 36-51 (2005).</li><li>Medalia, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+actin+networks+in+intact+filopodia.">Organization of actin networks in intact filopodia.</a> Curr. Biol. 17, 79-84 (2007).</li><li>Medalia, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+architecture+in+eukaryotic+cells+visualized+by+cryoelectron+tomography.">Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography.</a> Science. 298, 1209-1213 (2002).</li><li>Meyerson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+molecular+structures+of+HIV+envelope+glycoproteins+using+cryo-electron+tomography+and+automated+sub-tomogram+averaging.">Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging.</a> J. Vis. Exp. (58), e2770 (2011).</li><li>Nakatomi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+Hippocampal+Pyramidal+Neurons+after+Ischemic+Brain+Injury+by+Recruitment+of+Endogenous+Neural+Progenitors.">Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors.</a> Cell. 110, 429-441 (2002).</li><li>Peachey, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Microscopic+Observations+on+the+Accumulation+of+Divalent+Cations+in+Intramitochondrial+Granules.">Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules.</a> J. Cell. Biol. 20, 95-111 (1964).</li><li>Raza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+is+associated+with+elevated+intracellular+calcium+levels+and+altered+calcium+homeostatic+mechanisms+in+hippocampal+neurons.">Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons.</a> Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).</li><li>Scroggs, R. S., Fox, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+current+variation+between+acutely+isolated+adult+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+of+different+size.">Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size.</a> J. Physiol. 445, 639-658 (1992).</li><li>Squire, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamental neuroscience. , (2003).</li><li>Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+hit+hypotheses+for+dopamine+neuron+loss+in+Parkinson's+disease.">Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson's disease.</a> Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).</li><li>Tapia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+expression+of+glycine+and+GABA(A)+receptors+in+developing+spinal+cord+neurons.+Effects+on+neurite+outgrowth.">Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth.</a> Neuroscience. 108, 493-506 (2001).</li></ol>

Wir zeigen, dass embryonale Rattenneuronen (Hinterwurzelganglien und Hippocampus) auf Gold-Elektronenmikroskopie (EM) Gittern gewachsen und im Glaskörper Eis dünn genug für ihre Neuriten, die abgebildet werden unter Verwendung von 2-D-Kryo-EM-und 3-D-Kryo-eingefroren werden ET. Während Hippocampus Neuriten haben zuvor mit Kryo-ET 8,10,18,23 abgebildet wurde, detailliert ein Protokoll für die erfolgreiche Replikation genug mit im Handel erhältlichen Geräte gefehlt hat. Darüber hinaus, während ihre For...

Neuronen stellen die komplexe Schaltung für die Funktion des zentralen und peripheren Nervensystem durch die Ausarbeitung Dendriten und Axone, um Informationen, die oft recht lang, um mit nachgeschalteten Neuronen kommunizieren. Neuritenwachstum spielt eine fundamentale Rolle in der Embryonalentwicklung und neuronalen Differenzierung und Erhaltung von Neuriten kritisch unterstützt die Funktion des Nervensystems. Neuritische Prozesse verfügen kritisch in neuronalen Verletzungen und Regeneration sowie Erkrankungen des Nervensystems. Die Untersuchung der neuronalen Architektur ist entscheidend, sowohl die normalen und erkrankten Gehirn zu verstehen. Glücklicherweise gibt es physiologisch relevanten neuronalen Zellkultur-Systeme, dass komplexe und heterogene Zellstrukturen rekapitulieren kann. Auf der Grundlage der experimentellen Aufklärung der festen Plattformen effektive Visualisierung Strategien, die qualitativen und quantitativen Analysen der neuronalen Morphologie ermöglichen benötigt. Besonders nützlich wäreist eine detaillierte Methode, die eine einheitliche Plattform zur Visualisierung von Neuriten, beide Axonen und Dendriten im Nanometerbereich enthält. Traditionelle Elektronenmikroskopie erfordert die Verwendung von organischen Lösungsmittels während der Dehydratisierung und Harzeinbettung, die Verzerrungen in den Proben von ihrem wahren Zustand induzieren kann. So die Interpretation der Ergebnisse 4,9,25 Begrenzung - Bis heute sind die meisten strukturellen Charakterisierung auf der Nanometerskala auf größere Zellen oder Geweben, die zu solchen aggressiven Chemikalien ausgesetzt sind, basiert. Darüber hinaus für die Elektronenstrahldurch, Schnitte für Organismen oder Zell Vorsprünge aufweist eine Dicke von mehr als 1 um 12 erforderlich. Schließlich, geschnitten oder gefräst Gewebe Ergebnisse in der Sammlung von diskreten Scheibe spezifischen Datensätzen, so schwerfällig die Definition des Lang Funktion von Neuriten. Selbst für Kryo-EM, in der Schnitt eine tiefgefrorenen Probe möglich ist, stellt die Methode Kompression Artifwirkt ein. In den letzten Jahren haben die Forscher gelernt, wie Neuronen im Hippocampus direkt auf EM-Gitter und Flash-Einfrieren in flüssigem Ethan zu Neuriten mit Kryo-ET 8,10,18,23 anschließend visualisieren wachsen. Doch solche Studien entweder eine Sonderanfertigung 10,23 oder mangelnde Informationen über die Löschschritt zum Erzeugen dünn genug glasigen Eis für Routine-Visualisierung 8,18. Zum Beispiel empfiehlt eine Studie, die Verwendung von 30-40 sec für Abtupfen der EM Gitter 10, jedoch ist dieser Wert nicht für den allgemeinen Gebrauch optimiert, sondern ist spezifisch für diese maßgeschneiderte Tauchgefriergerät. Mit einer Sonderanfertigung, anstatt einen handelsüblichen 17 ein für die Aufrechterhaltung der Luftfeuchte vor stürzen Gefrieren der Probe kann eine Hürde für die weit verbreiteten Reproduzierbarkeit darstellen. Während diese Studien haben bei der Visualisierung von Neuriten Kryo-ET bahnbrech wurde, haben wir einen Schritt weiter, um die ap erkundenbarkeit der Kryo-ET zu einer Vielzahl von neuronalen Proben (hippocampalen und dorsalen Wurzelganglienneuronen). Darüber diskutieren wir beide optimale und suboptimale Ergebnisse sowie die möglichen Artefakte, die auftreten können mit einem Kryo-ET für solche Proben. Definieren einer detaillierten Technik für die Erhaltung und Visualisierung ganze Neuriten im Nanometerbereich in einer nahezu nativen Zustand würde die Fähigkeit für mehr Forscher zur Durchführung von ultrastrukturellen Studien zu verbessern. Zu diesem Zweck wird mit kommerziell erhältlichen Ausrüstung, um nicht fixierte, ungefärbten Neuronen vorzubereiten, zu visualisieren Neuriten beschreiben wir eine effektive und detaillierte Protokoll. Dies ist ein wichtiger erster Schritt zur Detaillierung der Ultrastruktur von gesunden Neuriten und den Grundstein für das Verständnis, was strukturelle Unterschiede im Nervensystem Modelle Krankheit vorliegen legen. Seit Kryo-ET kann nicht fixierten, ungefärbten Neuriten-Funktionen in 3-D auf der Nanometerskala zu beheben, wird das Verfahren machen es möglich, wie nieVordergrund zu neuritische Architektur 12 zu definieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="970">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Dumont #7 Tweezers</td>
			<td style="width:196px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:309px;">72803-01</td>
			<td style="width:171px;">For handling EM grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek Corp.</td>
			<td>P35G-1.5-10C</td>
			<td>For growing sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electron microscopy grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Holey Carbon, Au 200, R 2/2</td>
			<td>For growing sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium-free filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1541-055</td>
			<td>For blotting sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large flat point long tweezers</td>
			<td>Excelta Corporation</td>
			<td>E003-000590, 25-SA</td>
			<td>For blotting sample </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vitrification device and tweezers</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Vitrobot Mark III</td>
			<td>For freezing sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini grid storage boxes</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>160-40</td>
			<td>For storing EM grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo transfer holder</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Semi-automated tilt series acquisition software</td>
			<td>SerialEM</td>
			<td>http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image processing software</td>
			<td>IMOD eTomo</td>
			<td>http://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
			<td>For image processing</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Transmission electron microscope for cryoEM</td>
			<td>JEOL, Tokyo</td>
			<td>200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4k x 4k CCD camera</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-D annotation software</td>
			<td>Visage Imaging GmbH</td>
			<td>Amira/Avizo</td>
			<td>For processing 3-D data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Software for digitally stitching 2-D images</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td>For processing 2-D data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-118</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B-0252</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium tetraborate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B-9876</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-lysine </td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2636-500MG</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter system</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430758</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-27 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant rat b-NGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>556-NG</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3003-5G</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5&#39;-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503-100MG</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of primary neurons for visualizing neurites in a frozen-hydrated state using cryo-electron tomography

Neuriten, beide Dendriten und Axone sind neuronale zelluläre Prozesse, die die Leitung der elektrischen Impulse zwischen den Neuronen zu ermöglichen. Festlegen der Struktur von Neuriten ist entscheidend für das Verständnis, wie diese Prozesse bewegen, Materialien und Signale, die synaptische Kommunikation unterstützen. Elektronenmikroskopie (EM) wurde traditionell verwendet, um die ultrastrukturelle Merkmale in Neuriten beurteilen, jedoch kann die Exposition gegenüber organischen Lösemittel während der Dehydratisierung und Harzeinbettungsstrukturen verzerren. Ein wichtiges Ziel ist die unerfüllte Formulierung von Verfahren, die für die strukturelle Auswertungen nicht durch solche Artefakte beeinflusst ermöglichen. Hier haben wir eine detaillierte und reproduzierbare Protokoll für wachsende und Schockgefrieren ganze Neuriten von verschiedenen primären Neuronen auf Elektronenmikroskopie Gitter gefolgt von deren Untersuchung mit Kryoelektronentomographie (Kryo-ET) eingerichtet. Diese Technik ermöglicht 3-D-Visualisierung von gefrorenen, hydratisierten Neuriten in Nanometer-Auflösung, die Erleichterung assessment ihrer morphologischen Unterschiede. Unser Protokoll liefert eine beispiellose Ansicht der Hinterwurzelganglien (DRG) Neuriten und eine Visualisierung des Hippocampus in der Nähe von Neuriten-nativen Zustand. Als solche sind diese Methoden schaffen ein Fundament für zukünftige Studien auf Neuriten der beiden normalen Neuronen und die von neurologischen Erkrankungen betroffen.

Vor dem Einfrieren und Bildgebung mittels Kryo-ET, sollte leicht Mikroskopbilder der EM-Gitter, auf dem die Neuronen wachsen genommen werden. Neuriten sollten deutlich sichtbar, ohne signifikante Überlappung miteinander sein. Eine farbige Box in 3A repräsentiert einen Bereich, der vergrößerten wird, um eine höhere Vergrößerung in 3B, in der Neuriten erstrecken sich über die Gitterwerk des Gitters zu zeigen. Jedes Gitter-Platz ist einer löchrigen Kohlenstoffschicht, die die Nerv...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography at JoVE.com

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Neuronale Prozesse zur ultrastrukturellen Analyse zu erhalten, beschreiben wir ein Protokoll für die Beschichtung von primären Neuronen auf Elektronenmikroskopie Gitter gefolgt von einem Blitzgefrieren, wodurch Proben in einer Schicht von glasartigem Eis suspendiert. Diese Proben können mit einer Kryo-Elektronenmikroskop auf Strukturen im Nanometerbereich sichtbar zu prüfen.

Herstellung von primären Neuronen für die Visualisierung von Neuriten in einem tiefgefrorenen Zustand unter Verwendung von Kryo-Elektronentomographie

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Quantitative Analyse der synaptischen Vesikel Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Nervenzellen Granulat mit FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Forschung

Neurowissenschaften

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluoreszenzmarkierung Ermöglicht Gezielte Extracellular Einzel-Einheit Aufnahme von identifizierten Neuronen<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

Herstellung<em&gt; Drosophila</em&gt; Central Neuronen<em&gt; In situ</em&gt; Patch Clamping

Short generation times and facile genetic techniques make the fruit fly Drosophila melanogaster an excellent genetic model in fundamental neuroscience ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calciumphosphat-Transfektion von primären Hippocampus-Neuronen

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imaging dendritischen Dornen von Rat Primär Hippocampus Neuronen mit Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Primärkultur von Maus dopaminergen Neuronen

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Adult Maus Muskel-Nerven Vorbereitung für das Studium der Brenneigenschaften des Muskel-Afferenzen

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Measuring Connectivity in the Primary Visual Pathway in Human Albinism Using Diffusion Tensor Imaging and Tractography

Mess Konnektivität im primären Sehbahn im Bereich Human Albinismus Diffusion Tensor-Bildgebung und Traktographie

In albinism, the number of ipsilaterally projecting retinal ganglion cells (RGCs) is significantly reduced. The retina and optic chiasm have been proposed ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modellierung von neuronalen Tod und Degeneration in Maus primären zerebelläre Granulat Neuronen

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Live-Bilder von GLUT4 Protein Menschenhandel Maus primäre hypothalamische Neurone mit Dekonvolution Mikroskopie

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...