Name: preparation of primary neurons for visualizing neurites in a frozen-hydrated state using cryo-electron tomography
Uploaded: 2014-02-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography at JoVE.com

이 연구는 NIH 보조금 (PN2EY016525 및 P41GM103832)에 의해 지원되었다. SHS는 걸프 지역 컨소시엄 (NIH 그랜트 번호 T32EB009379)의 학제 간 생명 과학 교육에 대한 WM 켁 센터에 NanoBiology 학제 간 대학원 교육 프로그램의 화목에 의해 지원되었다. SHS는 해부 성장하고 DRG와 해마 세포를 유리화, cryo 종 및 DRG와 해마 축삭의 크라이 ET 데이터를 수집, 재구성 및 틸트 시리즈 색상 주석. MRG는 해부와 MNR의 실험실에서 해마의 세포를 제공했다. SC는 경사 시리즈 주석의 지원. SHS는 뉴런을 해부하고 성장하는 방법에 대한 CW에 의해 훈련되었다. SHS, WCM, 화장실은 실험을 고안. SHS는 다른 저자의 의견으로 원고를 준비했다. 이 비디오는 t의 Biozentrum의 세포 이미징 및 NanoAnalytics (C-CINA)를위한 센터에서 촬영되었다대학 바젤 그. C-CINA는 스위스 바젤에있는 ETH 취리히의 바이오 시스템 공학 (D-BSSE)의 부서에 통합되어 있습니다.

1. 도금 차 뉴런을위한 EM 그리드와 요리 준비 <ol><li> 적어도 25 배의 배율로 광학 현미경을 사용하여 금 EM 그리드에 구멍 투성이의 탄소의 무결성을 검사합니다. 확인 탄소 구멍은&gt; 98 % 그대로 유지되어 있는지 확인하십시오. </li><li> 기본 뉴런 도금의 경우, EM 격자를 화염 살균 동시에 그 친수성 ​​렌더링하는 분젠 버너를 사용합니다. 가장자리가 아닌 중앙 그리드 화 면적으로 EM 그리드를 데...

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	<li>Al-Amoudi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitreous+sections.">Cryo-electron microscopy of vitreous sections.</a> EMBO J. 23, 3583-3588 (2004).</li><li>Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease-like+dystrophic+neurites+characteristically+associated+with+senile+plaques+are+not+found+within+other+neurodegenerative+diseases+unless+amyloid+beta-protein+deposition+is+present.">Alzheimer's disease-like dystrophic neurites characteristically associated with senile plaques are not found within other neurodegenerative diseases unless amyloid beta-protein deposition is present.</a> Brain Res. 606, 10-18 (1993).</li><li>Binks, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modern characterization methods of surfactant systems. , (1999).</li><li>Briggman, K. L., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+neural+circuit+reconstruction+with+volume+electron+microscopy+techniques.">Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 16, 562-570 (2006).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryotomography+of+bacterial+cells.">Electron cryotomography of bacterial cells.</a> J. Vis. Exp. 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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> J. Struct. Biol. 152, 36-51 (2005).</li><li>Medalia, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+actin+networks+in+intact+filopodia.">Organization of actin networks in intact filopodia.</a> Curr. 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(58), e2770 (2011).</li><li>Nakatomi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+Hippocampal+Pyramidal+Neurons+after+Ischemic+Brain+Injury+by+Recruitment+of+Endogenous+Neural+Progenitors.">Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors.</a> Cell. 110, 429-441 (2002).</li><li>Peachey, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Microscopic+Observations+on+the+Accumulation+of+Divalent+Cations+in+Intramitochondrial+Granules.">Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules.</a> J. Cell. 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우리는 쥐의 배아 신경 (척수 신경절 및 해마는) 골드 전자 현미경 (EM) 그리드에 성장 및 2-D cryo 종 및 3-D의 극저온을 사용하여 몇 군데되는 자신의 신경 돌기에 충분한 얇은 유리 같은 얼음에 고정 할 수 있다는 것을 보여 ET. 해마의 신경 돌기 이전 크라이 ET 8,10,18,23을 사용하여 몇 군데되었지만, 프로토콜이 부족 한 상업적으로 사용 가능한 장치를 사용하여 성공적으로 복제 충분히 상세?...

뉴런은 다운 스트림 신경과 의사 소통을하기위한 정보와 축삭, 종종 아주 긴을받을 모 수석을 정교화하여 중앙과 말초 신경계의 기능에 대한 복잡한 회로의 핵심을 설정합니다. 신경 돌기 가지 신경계의 비판적 기능을 지원 배아 발달과 신경 세포의 분화 및 신경 돌기의 유지 보수 동안 근본적인 역할을한다. Neuritic 과정은 신경 세포의 손상 및 재생뿐만 아니라, 신경계 장애에 비판적 있습니다. 신경 세포의 구조의 연구는 모두 정상 및 병에 걸린 뇌를 이해하는 것이 중요합니다. 다행히, 생리학 관련 신경 세포 배양 시스템은 복잡하고 이질적인 세포 구조를 요점을 되풀이 할 수있다. 고체 실험 플랫폼, 신경 세포의 형태의 정성 및 정량 분석​​을 가능하게 효과적인 시각화 전략의 해명에 따라 필요합니다. 특히 유용한 것나노 미터 스케일에서 신경 돌기, 축삭과 수상 돌기 모두를 시각화하기위한 일관성있는 플랫폼을 제공하는 자세한 방법합니다. 기존의 전자 현미경은 그들의 진정한 상태에서 시험편에 왜곡을 유도 할 수있는 탈수 수지 매립 중에 유기 용매의 사용을 필요로한다. 따라서 연구 결과 4,9,25의 해석을 제한 - 현재까지 나노 미터 스케일에서 가장 구조적 특성 분석은 이러한 가혹한 화학 물질에 노출되는 더 큰 세포 또는 조직을 기반으로합니다. 더욱이, 전자빔 침투, 절편은 1 내지 12 ㎛보다 큰 두께를 나타내는 생물체 또는 세포 돌기 요구된다. 마지막으로, 신경 돌기의 신장 기능의 성가신 정의하고, 개별 슬라이스 특정 데이터 세트의 컬렉션에 조직의 결과를 단면 또는 가공. 비록 극저온-EM위한 냉동 수화 시험편을 구획하는 것이 가능하는, 상기 방법은 압축 ARTIF 도입1 역할을합니다. 최근 몇 년 동안, 연구자들은 EM 그리드 및 플래시 동결 이후 크라이 ET 8,10,18,23를 사용하여 신경 돌기를 시각화하는 액체 에탄을 직접 해마의 신경 세포를 성장하는 방법을 배웠습니다. 그러나, 이러한 연구는 맞춤 장치 10,23, 또는 일상적인 시각화 (8, 18) 얇은만큼 유리 같은 얼음을 생성하는 모래 바닥 단계에 부족 세부 사항을 사용 하나. 예를 들어, 한 연구는 EM 그리드 (10)를 모래 바닥에 대한 30 ~ 40 초를 사용할 것을 권장하지만,이 값은 일반적으로 사용하지 최적화되어 있지만, 사용자 정의 - 만든 플 런지 냉동 장치에 대해 특정입니다. 플 런지 동결하는 샘플을 이전의 습도를 유지하기위한 사용자 정의 만든 장치가 아닌 시중에서 한 17를 사용하여 광범위한 재현성에 대한 장애물을 초래할 수 있습니다. 이 연구는 극저온 ET으로 신경 돌기를 시각화에 획기적인되었지만, 우리는 AP를 탐험 한 단계 더 촬영했습니다신경 세포의 표본 (해마와 후근 신경절 신경 세포)의 다양한 크라이 ET의 plicability. 또한, 우리는 최선과 차선의 결과뿐만 아니라, 하나는 시편 크라이 ET를 사용하여 발생할 수있는 잠재적 이슈를 모두 설명합니다. 네이티브에 가까운 상태로 보존하고 나노 미터 규모로 전체의 신경 돌기를 시각화에 대한 상세한 기술을 정의하는 것은 미세 구조 연구를 수행하기 위해 더 많은 연구에 대한 능력을 향상시킬 것입니다. 이를 위해, 우리는 신경 돌기를 시각화하는 정착, 흠 뉴런을 제조 시판 장비를 이용하여 효율적이고 상세한 프로토콜을 설명한다. 이것은 건강한 신경 돌기의 미세 구조를 자세히 설명하고 구조적 차이가 신경계 질병 모델에 존재하는 것을 이해하기위한 토대를 마련하기 위해 향한 중요한 첫 번째 단계입니다. CRYO-ET는 나노 미터 스케일에서 3-D에 고정되지 않은, 흠없는 신경 돌기의 기능을 분석 할 수 있기 때문에,이 방법은 가능한 결코로하게 될 것입니다neuritic 건축 (12)를 정의하는 앞.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="970">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Dumont #7 Tweezers</td>
			<td style="width:196px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:309px;">72803-01</td>
			<td style="width:171px;">For handling EM grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek Corp.</td>
			<td>P35G-1.5-10C</td>
			<td>For growing sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electron microscopy grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Holey Carbon, Au 200, R 2/2</td>
			<td>For growing sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium-free filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1541-055</td>
			<td>For blotting sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large flat point long tweezers</td>
			<td>Excelta Corporation</td>
			<td>E003-000590, 25-SA</td>
			<td>For blotting sample </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vitrification device and tweezers</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Vitrobot Mark III</td>
			<td>For freezing sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini grid storage boxes</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>160-40</td>
			<td>For storing EM grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo transfer holder</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Semi-automated tilt series acquisition software</td>
			<td>SerialEM</td>
			<td>http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image processing software</td>
			<td>IMOD eTomo</td>
			<td>http://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
			<td>For image processing</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Transmission electron microscope for cryoEM</td>
			<td>JEOL, Tokyo</td>
			<td>200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4k x 4k CCD camera</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-D annotation software</td>
			<td>Visage Imaging GmbH</td>
			<td>Amira/Avizo</td>
			<td>For processing 3-D data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Software for digitally stitching 2-D images</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td>For processing 2-D data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-118</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B-0252</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium tetraborate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B-9876</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-lysine </td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2636-500MG</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter system</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430758</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-27 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant rat b-NGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>556-NG</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3003-5G</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5&#39;-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503-100MG</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of primary neurons for visualizing neurites in a frozen-hydrated state using cryo-electron tomography

신경 돌기, 모두 수상 돌기 및 축색 돌기는 뉴런 사이의 전기 자극의 전도를 가능하게 신경 세포 과정이다. 신경 돌기의 구조를 정의하는 것은 이러한 과정이 시냅스 통신을 지원 자료 및 신호를 이동하는 방법을 이해하는 것이 중요합니다. 전자 현미경 (EM)는 전통적으로 신경 돌기 내의 미세 기능을 평가하는 데 사용되었습니다 있지만, 탈수 및 수지 매립시 유기 용제에 노출 구조를 왜곡 할 수 있습니다. 중요한 충족 목표는 유물의 영향을받지 구조 평가를 허용 절차의 수립이다. 여기, 우리는 성장하고 극저온 전자 단층 촬영 (크라이 ET)과의 시험 다음에 전자 현미경 그리드에 다른 차 신경의 플래시 냉동 전체의 신경 돌기에 대한 상세하고 재현 가능한 프로토콜을 설립했다. 이 기술은 ASSE 용이 나노 미터 분해능에서 냉동 수화 신경 돌기의 3-D 시각화를 허용자신의 형태 학적 차이 ssment. 우리의 프로토콜은 후근 신경절 (DRG) 신경 돌기, 그들의 네이티브에 가까운 상태에서 해마의 신경 돌기의 시각화의 전례가없는보기를 얻을 수 있습니다. 따라서,이 방법은 정상적인 신경 세포와 신경 장애에 의해 영향을 사람들 모두의 신경 돌기에 미래 연구를위한 기초를 만들 수 있습니다.

이전 크라이 ET를 통해 동결 및 이미징, 광학 현미경 이미지는 신경 세포가 성장하고있는 EM 그리드주의해야한다. 신경 돌기가 서로 상당한 중복하지 않고 명확하게 볼 수 있어야합니다. 그림 (a)에 색 상자가 확대 된에 신경 돌기가 격자의 격자에 걸쳐 확장되는 그림 (b)에서 높은 배율을 표시하는 영역을 나타냅니다. 각 그리드 사각형은 뉴런과 자신의 신경 돌기를 지원하...

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Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

미세 구조 분석을 위해 신경 프로세스를 유지하기 위해, 우리는 유리 같은 얼음의 층에 현탁 샘플을 항복, 플래시 냉동으로 다음 전자 현미경 그리드에 대한 기본 뉴런의 도금을위한 프로토콜을 설명합니다. 이들 샘플은 나노 미터 스케일에서 구조를 시각화하는 극저온 전자 현미경으로 관찰 할 수있다.

극저온 전자 단층 촬영을 사용하여 냉동 수화 상태에서 신경 돌기를 시각화에 대한 기본 뉴런의 준비

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

FM 염료를 사용하여 양식 소뇌 과립 뉴런에서 시냅틱 소포 풀 보충의 정량 분석

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

연구

신경과학

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

역행 형광 라벨이 확인 된 신경 세포의 표적 세포 외 단일 단위 기록을 허용<em&gt; 생체 내</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

의 작성<em&gt; Drosophila</em에 대한&gt; 중부 뉴런<em&gt; 현장에서</em&gt; 패치 클램핑

Short generation times and facile genetic techniques make the fruit fly Drosophila melanogaster an excellent genetic model in fundamental neuroscience ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

차 해마 신경 세포의 칼슘 인산염 형질

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

구조적 조명 현미경을 사용하여 쥐 차 해마 신경 세포의 돌기 쪽 이미징

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

마우스 도파민 뉴런의 차 문화

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

<em&gt; 체외</em근육의 구 심성의 소성 특성을 연구&gt; 성인 마우스 근육 - 신경 준비

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Measuring Connectivity in the Primary Visual Pathway in Human Albinism Using Diffusion Tensor Imaging and Tractography

확산 텐서 영상 및 Tractography를 사용하여 인간의 백색증의 기본 시각 통로에 연결 측정

In albinism, the number of ipsilaterally projecting retinal ganglion cells (RGCs) is significantly reduced. The retina and optic chiasm have been proposed ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

신경 죽음 및 마우스 기본 소 뇌과 립 신경에 변성을 모델링

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

마우스 기본 Hypothalamic 뉴런 Deconvolution 현미경을 사용 하 여 매매 GLUT4 단백질의 라이브 이미지

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...