Name: preparation of primary neurons for visualizing neurites in a frozen-hydrated state using cryo-electron tomography
Uploaded: 2014-02-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography at JoVE.com

Esta pesquisa foi suportada pelos NIH bolsas (PN2EY016525 e P41GM103832). SHS foi apoiado por uma bolsa do Programa do Centro Keck WM Interdisciplinar de Biociências de Formação da Costa do Golfo Consórcios (NIH Grant No. T32EB009379) Formação de Pós-Graduação Interdisciplinar Nanobiologia. SHS dissecado, cresceu e vitrificados DRG e células do hipocampo; coletadas crio-EM e dados crio-ET de DRG e axônios do hipocampo; reconstruído e cor-anotada a série de inclinação. MRG dissecado e desde as células do hipocampo no laboratório do MNR. SC assistida em anotação série de inclinação. SHS foi treinado por CW sobre como dissecar e crescer neurônios. SHS, WCM e WC concebeu os experimentos. SHS preparou o manuscrito com a entrada de outros autores. Este vídeo foi filmado no Centro de Imaging and Cellular NanoAnalytics (C-CINA) do Biozentrum de tele Universidade de Basel. C-CINA está integrada no Departamento de Ciência e Engenharia Biosystems (D-BSSE) da ETH Zürich, localizada em Basileia, Suíça.

1. Preparar pratos com EM Grids para Galvanização primárias Neurônios <ol><li> Examine a integridade do carbono perfurado nas grades EM ouro usando um microscópio de luz com ampliação de pelo menos 25X. Certifique-se que buracos de carbono são&gt; 98% intacto. </li><li> Para chapeamento neurônios primários, use um bico de Bunsen para inflamar-esterilizar as grades EM e ao mesmo tempo torná-los hidrofílico. Use uma pinça para pegar a grade EM pelas bordas, e não a área em grade central. CUIDADO: Nunca de...

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	<li>Al-Amoudi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitreous+sections.">Cryo-electron microscopy of vitreous sections.</a> EMBO J. 23, 3583-3588 (2004).</li><li>Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease-like+dystrophic+neurites+characteristically+associated+with+senile+plaques+are+not+found+within+other+neurodegenerative+diseases+unless+amyloid+beta-protein+deposition+is+present.">Alzheimer's disease-like dystrophic neurites characteristically associated with senile plaques are not found within other neurodegenerative diseases unless amyloid beta-protein deposition is present.</a> Brain Res. 606, 10-18 (1993).</li><li>Binks, B. 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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> J. Struct. Biol. 152, 36-51 (2005).</li><li>Medalia, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+actin+networks+in+intact+filopodia.">Organization of actin networks in intact filopodia.</a> Curr. Biol. 17, 79-84 (2007).</li><li>Medalia, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+architecture+in+eukaryotic+cells+visualized+by+cryoelectron+tomography.">Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography.</a> Science. 298, 1209-1213 (2002).</li><li>Meyerson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+molecular+structures+of+HIV+envelope+glycoproteins+using+cryo-electron+tomography+and+automated+sub-tomogram+averaging.">Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging.</a> J. Vis. Exp. (58), e2770 (2011).</li><li>Nakatomi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+Hippocampal+Pyramidal+Neurons+after+Ischemic+Brain+Injury+by+Recruitment+of+Endogenous+Neural+Progenitors.">Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors.</a> Cell. 110, 429-441 (2002).</li><li>Peachey, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Microscopic+Observations+on+the+Accumulation+of+Divalent+Cations+in+Intramitochondrial+Granules.">Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules.</a> J. Cell. 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Nós mostramos que ratos neurônios embrionários (gânglio da raiz dorsal e hipocampo) podem ser cultivadas em microscopia eletrônica de ouro (EM) grades e congelado em gelo vítreo fina o suficiente para as suas neurites a ser fotografada usando 2-D crio-EM e 3-D crio- ET. Enquanto neurites hipocampo foram previamente visualizados utilizando crio-ET 8,10,18,23, um protocolo detalhado para a replicação suficiente de sucesso utilizando dispositivos comercialmente disponíveis tem faltado. Além disso, enqu...

Neurónios estabelecer o essencial circuitos complexos para a função dos sistemas nervosos central e periférico, através da elaboração de dendrites e axónios receber informação, muitas vezes muito demorado, para se comunicar com os neurónios a jusante. Crescimento de neurites desempenha um papel fundamental durante o desenvolvimento embrionário e na diferenciação e manutenção de neurites neuronal suporta criticamente a função do sistema nervoso. Processos neuriticos também apresentam criticamente em lesões neuronais e de regeneração, bem como distúrbios do sistema nervoso. O estudo da arquitetura neuronal é crucial para entender tanto o cérebro normal e doente. Felizmente, existem sistemas de cultura de células neuronais fisiologicamente relevantes que podem recapitular estruturas celulares complexos e heterogêneos. Com base na elucidação de plataformas experimentais sólidos, estratégias eficazes de visualização que permitem análises qualitativas e quantitativas da morfologia neuronal são necessários. Especialmente útil seriaser uma metodologia detalhada que fornece uma plataforma consistente para a visualização de neurites, ambos os axônios e dendritos em escala nanométrica. Microscopia tradicional elétron requer o uso de solvente orgânico durante a desidratação e incorporação de resina, o que pode induzir distorções nas amostras de seu verdadeiro estado. Até à data, a maioria das caracterizações estruturais em escala nanométrica são baseados em células ou tecidos maiores, que são submetidos a tais produtos químicos - limitando, assim, a interpretação dos resultados 4,9,25. Além disso, para a penetração do feixe de electrões, de corte é necessária para que os organismos celulares ou saliências que apresentam uma espessura superior a 1 um 12. Finalmente, os resultados de tecido seccionados ou branqueado no conjunto de conjuntos de dados discretos específico slice, tornando complicada a definição da característica alongada de neurites. Mesmo para crio-EM, em que o corte de um espécime congelado hidratado é possível, o método apresenta compressão ArtifAtos 1. Nos últimos anos, os pesquisadores aprenderam a crescer neurônios do hipocampo diretamente em grades e EM-los em etano líquido para visualizar posteriormente neurites usando crio-ET 8,10,18,23 de congelamento flash. No entanto, tais estudos ou usar um dispositivo feito sob medida 10,23, ou detalhes de falta na etapa mata-borrão para a geração de gelo vítreo suficientemente fina para visualização rotina 8,18. Por exemplo, um estudo recomenda o uso de 30-40 segundos para secar a grade EM 10, no entanto, este valor não é otimizado para uso geral, mas é específico para esse dispositivo de congelamento mergulho feito por encomenda. Usando um dispositivo feito sob medida, em vez de um comercialmente disponível um 17 para a manutenção de umidade antes de mergulhar de congelamento da amostra pode representar um obstáculo para a reprodutibilidade generalizada. Embora esses estudos têm sido inovador em visualizar neurites por crio-ET, demos um passo à frente para explorar a applicability de crio-ET para uma variedade de amostras (neuronais do hipocampo e do gânglio da raiz dorsal, neurónios). Além disso, discute-se ambos os resultados ótimos e subótimos, bem como os possíveis artefatos que se pode encontrar usando crio-ET para tais espécimes. Definindo uma técnica detalhada para a preservação e visualizar neurites inteiros em escala nanométrica em um estado quase nativo iria aumentar a capacidade para mais pesquisadores para realizar estudos ultra-estruturais. Para este efeito, descrevem um protocolo eficaz e detalhado usando equipamentos disponíveis comercialmente para preparar a não fixadas, os neurónios não-coradas para visualizar as neurites. Este é um primeiro passo importante para detalhar a ultra-estrutura das neurites saudáveis ​​e estabelecer as bases para a compreensão do que estão presentes em modelos de doenças do sistema nervoso diferenças estruturais. Desde crio-ET pode resolver não corrigidos, características neurite não coradas em 3-D em escala nanométrica, o método, será possível, como nunca serantes de definir a arquitetura neuritic 12.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="970">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Dumont #7 Tweezers</td>
			<td style="width:196px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:309px;">72803-01</td>
			<td style="width:171px;">For handling EM grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek Corp.</td>
			<td>P35G-1.5-10C</td>
			<td>For growing sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electron microscopy grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Holey Carbon, Au 200, R 2/2</td>
			<td>For growing sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium-free filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1541-055</td>
			<td>For blotting sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large flat point long tweezers</td>
			<td>Excelta Corporation</td>
			<td>E003-000590, 25-SA</td>
			<td>For blotting sample </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vitrification device and tweezers</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Vitrobot Mark III</td>
			<td>For freezing sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini grid storage boxes</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>160-40</td>
			<td>For storing EM grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo transfer holder</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Semi-automated tilt series acquisition software</td>
			<td>SerialEM</td>
			<td>http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image processing software</td>
			<td>IMOD eTomo</td>
			<td>http://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
			<td>For image processing</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Transmission electron microscope for cryoEM</td>
			<td>JEOL, Tokyo</td>
			<td>200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4k x 4k CCD camera</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-D annotation software</td>
			<td>Visage Imaging GmbH</td>
			<td>Amira/Avizo</td>
			<td>For processing 3-D data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Software for digitally stitching 2-D images</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td>For processing 2-D data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-118</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B-0252</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium tetraborate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B-9876</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-lysine </td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2636-500MG</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter system</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430758</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-27 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant rat b-NGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>556-NG</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3003-5G</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5&#39;-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503-100MG</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of primary neurons for visualizing neurites in a frozen-hydrated state using cryo-electron tomography

Neuritos, ambos os dendritos e axônios, são processos celulares neuronais que permitem a condução de impulsos elétricos entre os neurônios. Definir a estrutura de neurites é fundamental para a compreensão de como esses processos mover materiais e sinais que suportem comunicação sináptica. A microscopia eletrônica (EM) tem sido tradicionalmente usada para avaliar as características ultra-estruturais dentro de neurites, no entanto, a exposição a solventes orgânicos durante a desidratação e resina incorporação podem alterar as estruturas. Um objetivo importante não atendida é a formulação de procedimentos que permitam avaliações estruturais não impactadas por tais artefatos. Aqui, nós estabelecemos um protocolo detalhado e reprodutível para o cultivo e de congelamento de flash neurites inteiros de diferentes neurônios primários em grades de microscopia eletrônica, seguido por seu exame com tomografia crio-elétron (crio-ET). Esta técnica permite a visualização 3-D de congelados, neurites hidratados com resolução nanométrica, facilitando assessment de suas diferenças morfológicas. Nosso protocolo produz uma visão sem precedentes da raiz dorsal (DRG) gânglio neurites, e uma visualização de neurites hipocampo em seu estado quase original. Como tal, estes métodos de criar uma base para futuros estudos sobre neurites de ambos os neurônios normais e aqueles afetados por distúrbios neurológicos.

Antes de congelamento e de imagens via crio-ET, devem ser tomadas da rede de EM em que os neurônios estão crescendo imagens de microscópio de luz. Neuritos deve ser claramente visível, sem sobreposição significativa com o outro. Uma caixa colorida na Figura 3A representa uma área que é ampliada em mostrar um maior ampliação na Figura 3B, em que as neurites se estendem através da treliça da grade. Cada grade quadrados é composto por uma película de carbono perfurado que sup...

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Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Para preservar processos neuronais para análise ultra-estrutural, nós descrevemos um protocolo para revestimento dos neurônios primários em grades de microscopia eletrônica seguido de congelamento flash, rendendo amostras suspensas em uma camada de gelo vítreo. Essas amostras podem ser examinadas com um microscópio crio-eletrônico para visualizar estruturas em escala nanométrica.

Preparação de primário neurônios para visualizar Neuritos num Estado Frozen-hidratado Usando Cryo-Electron Tomografia

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Análise quantitativa de Reposição da vesícula sináptica Piscina em Cultured neurônios granulares do cerebelo usando Dyes FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Neurociência

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Labeling fluorescentes retrógrada Permite alvejado Extracelular Gravação Single-unidade dos neurônios identificados<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

Preparação de<em&gt; Drosophila</em&gt; Os neurônios centrais para<em&gt; In situ</em&gt; Patch aperto

Short generation times and facile genetic techniques make the fruit fly Drosophila melanogaster an excellent genetic model in fundamental neuroscience ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Fosfato de cálcio transfecção de primário neurônios do hipocampo

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imagiologia espinhas dendríticas dos neurônios do hipocampo de rato primária usando Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Cultura primária de neurônios dopaminérgicos mouse

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Um<em&gt; In Vitro</emPreparação Muscle-nervo&gt; Adulto mouse para estudar as propriedades de queima de músculos aferentes

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Measuring Connectivity in the Primary Visual Pathway in Human Albinism Using Diffusion Tensor Imaging and Tractography

Medição Conectividade no Visual principal via de albinismo humano utilizando tensor de difusão e tractography

In albinism, the number of ipsilaterally projecting retinal ganglion cells (RGCs) is significantly reduced. The retina and optic chiasm have been proposed ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modelagem de morte Neuronal e a degeneração no Mouse grânulo cerebelar primária de neurônios

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Imagens ao vivo da proteína GLUT4 tráfico de Mouse de neurônios hipotálamo primário usando microscopia de deconvolução

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...