Name: preparation of primary neurons for visualizing neurites in a frozen-hydrated state using cryo-electron tomography
Uploaded: 2014-02-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography at JoVE.com

Bu araştırma NIH hibe (PN2EY016525 ve P41GM103832) tarafından desteklenmiştir. SHS Gulf Coast Konsorsiyum (NIH Hibe No T32EB009379) Disiplinlerarası Biyobilim Eğitim WM Keck Merkezi&#39;nin Nanobiyoloji Disiplinlerarası Lisansüstü Eğitim Programı bir burs ile desteklenmiştir. SHS, disseke büyüdü ve DRG ve hipokampus hücrelerini vitrifiye, cryo-EM ve DRG ve hipokampal akson kriyo-ET toplanan verileri, yeniden ve tilt serisi renk açıklamalı. MRG disseke ve MnR laboratuarında hipokampal hücreleri sağladı. SC tilt serisi açıklama destekli. SHS nöronlar incelemek ve büyümeye nasıl CW tarafından eğitildi. SHS, WCM ve WC deneyler tasarlanmıştı. SHS diğer yazarlar girişi ile el yazması hazırladı. Bu video t Biozentrum Hücresel Görüntüleme ve NanoAnalytics (C-Cina) için Merkezi&#39;nde çekildiÜniversite Basel diye. C-Cina Basel, İsviçre&#39;de bulunan ETH Zürich arasında Biyosistem Bilimi ve Mühendisliği (D-BSSE) için Bölümü entegre edilmiştir.

1.. Kaplama İlköğretim Nöronlar EM Izgaralara Yemekleri Hazırlama <ol><li> En az 25X büyütmede ışık mikroskobu kullanarak altın EM ızgaraları holey karbon bütünlüğünü inceleyin. Emin karbon delikleri&gt;% 98 sağlam olduğundan emin olun. </li><li> Birincil nöronları kaplama için, EM ızgaraları alev sterilize ve aynı anda onları hidrofilik işlemek için bir Bunsen beki kullanın. Kenarıyla değil, merkezi ızgarah alanı ile EM ızgara almak için cımbız kullanın. DİKKAT: gözetimsiz ya...

<ol>
	<li>Al-Amoudi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitreous+sections.">Cryo-electron microscopy of vitreous sections.</a> EMBO J. 23, 3583-3588 (2004).</li><li>Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease-like+dystrophic+neurites+characteristically+associated+with+senile+plaques+are+not+found+within+other+neurodegenerative+diseases+unless+amyloid+beta-protein+deposition+is+present.">Alzheimer's disease-like dystrophic neurites characteristically associated with senile plaques are not found within other neurodegenerative diseases unless amyloid beta-protein deposition is present.</a> Brain Res. 606, 10-18 (1993).</li><li>Binks, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modern characterization methods of surfactant systems. , (1999).</li><li>Briggman, K. L., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+neural+circuit+reconstruction+with+volume+electron+microscopy+techniques.">Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 16, 562-570 (2006).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryotomography+of+bacterial+cells.">Electron cryotomography of bacterial cells.</a> J. Vis. Exp. (39), e1943 (2010).</li><li>DiFiglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+of+huntingtin+in+neuronal+intranuclear+inclusions+and+dystrophic+neurites+in+brain.">Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain.</a> Science. 277, 1990-1993 (1997).</li><li>Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+aqueous+suspensions.">Frozen aqueous suspensions.</a> Ultramicroscopy. 10, 55-61 (1982).</li><li>Fern&#225;ndez-Busnadiego, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+molecular+organization+of+the+neuron+by+cryo-electron+tomography.">Insights into the molecular organization of the neuron by cryo-electron tomography.</a> J. Electron Microsc. 60, 137-148 (2011).</li><li>Frey, T. G., Perkins, G. A., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+tomography+of+membrane-bound+cellular+organelles.">Electron tomography of membrane-bound cellular organelles.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 199-224 (2006).</li><li>Garvalov, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminal+particles+within+cellular+microtubules.">Luminal particles within cellular microtubules.</a> J. Cell. Biol. 174, 759-765 (2006).</li><li>Gr&#252;newald, K., Cyrklaff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+complex+viruses+and+virus-infected+cells+by+electron+cryo+tomography.">Structure of complex viruses and virus-infected cells by electron cryo tomography.</a> Curr. Opin. Microbiol. 9, 437-442 (2006).</li><li>Gu, J., Bourne, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structural bioinformatics. , (2009).</li><li>De Hoop, M. J., Meyn, L., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons+and+astrocytes+from+fetal+rodent+brain.">Culturing hippocampal neurons and astrocytes from fetal rodent brain.</a> Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, (1998).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+Block-Face+Scanning+Electron+Microscopy+to+Reconstruct+Three-Dimensional+Tissue+Nanostructure.">Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure.</a> PLoS Biol. 2, e329 (2004).</li><li>Fink, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+regulation+of+neurite+extension+and+synapse+formation+by+the+beta+but+not+the+alpha+isoform+of+CaMKII.">Selective regulation of neurite extension and synapse formation by the beta but not the alpha isoform of CaMKII.</a> Neuron. 39, 283-297 (2003).</li><li>Jacob, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+matrix+granules:+their+behavior+during+changing+metabolic+situations+and+their+relationship+to+contact+sites+between+inner+and+outer+mitochondrial+membranes.">Mitochondrial matrix granules: their behavior during changing metabolic situations and their relationship to contact sites between inner and outer mitochondrial membranes.</a> Microsc. Res. Tech. 27, 307-318 (1994).</li><li>Jensen, G. J., Briegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+electron+cryotomography+is+opening+a+new+window+onto+prokaryotic+ultrastructure.">How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).</li><li>Ibiricu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo+Electron+Tomography+of+Herpes+Simplex+Virus+during+Axonal+Transport+and+Secondary+Envelopment+in+Primary+Neurons.">Cryo Electron Tomography of Herpes Simplex Virus during Axonal Transport and Secondary Envelopment in Primary Neurons.</a> PLoS Pathog. 7, e1002406 (2011).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Koning, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo+electron+tomography+of+vitrified+fibroblasts:+microtubule+plus+ends+in+situ.">Cryo electron tomography of vitrified fibroblasts: microtubule plus ends in situ.</a> J. Struct. Biol. 161, 459-468 (2008).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).</li><li>Lotharius, J., Brundin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+Parkinson's+disease:+dopamine,+vesicles+and+alpha-synuclein.">Pathogenesis of Parkinson's disease: dopamine, vesicles and alpha-synuclein.</a> Nat. Rev. Neurosci. 3, 932-942 (2002).</li><li>Luci&#263;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+imaging+of+neurons+grown+in+culture:+from+light+microscopy+to+cryo-electron+tomography.">Multiscale imaging of neurons grown in culture: from light microscopy to cryo-electron tomography.</a> J. Struct. Biol. 160, 146 (2007).</li><li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and.">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and.</a> 2, 152-160 (2007).</li><li>Marsh, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+tomographic+studies+of+the+mammalian+Golgi.">Lessons from tomographic studies of the mammalian Golgi.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1744, 273-292 (2005).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> J. Struct. Biol. 152, 36-51 (2005).</li><li>Medalia, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+actin+networks+in+intact+filopodia.">Organization of actin networks in intact filopodia.</a> Curr. Biol. 17, 79-84 (2007).</li><li>Medalia, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+architecture+in+eukaryotic+cells+visualized+by+cryoelectron+tomography.">Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography.</a> Science. 298, 1209-1213 (2002).</li><li>Meyerson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+molecular+structures+of+HIV+envelope+glycoproteins+using+cryo-electron+tomography+and+automated+sub-tomogram+averaging.">Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging.</a> J. Vis. Exp. (58), e2770 (2011).</li><li>Nakatomi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+Hippocampal+Pyramidal+Neurons+after+Ischemic+Brain+Injury+by+Recruitment+of+Endogenous+Neural+Progenitors.">Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors.</a> Cell. 110, 429-441 (2002).</li><li>Peachey, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Microscopic+Observations+on+the+Accumulation+of+Divalent+Cations+in+Intramitochondrial+Granules.">Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules.</a> J. Cell. Biol. 20, 95-111 (1964).</li><li>Raza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+is+associated+with+elevated+intracellular+calcium+levels+and+altered+calcium+homeostatic+mechanisms+in+hippocampal+neurons.">Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons.</a> Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).</li><li>Scroggs, R. S., Fox, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+current+variation+between+acutely+isolated+adult+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+of+different+size.">Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size.</a> J. Physiol. 445, 639-658 (1992).</li><li>Squire, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamental neuroscience. , (2003).</li><li>Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+hit+hypotheses+for+dopamine+neuron+loss+in+Parkinson's+disease.">Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson's disease.</a> Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).</li><li>Tapia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+expression+of+glycine+and+GABA(A)+receptors+in+developing+spinal+cord+neurons.+Effects+on+neurite+outgrowth.">Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth.</a> Neuroscience. 108, 493-506 (2001).</li></ol>

Biz sıçan embriyonik nöronlar (dorsal kök ganglion ve hipokampus) altın, elektron mikroskobu (EM) ızgaralar üzerinde büyümüş ve 2-D cryo-EM ve 3-D kriyo-kullanarak görüntülü onların neurites için yeterince ince vitreus buz donmuş olabileceğini göstermektedir ET. Hipokampal nevrotiler önceden kriyo-ET 8,10,18,23 kullanarak görüntülü olsa da, bir protokol eksik olmuştur piyasada mevcut cihazlar kullanılarak başarılı çoğaltma için yeterince ayrıntılı. Araştırma hipokampal ne...

Nöronlar alt nöronlar ile iletişim kurmak için bilgi ve aksonlar, genellikle oldukça uzun, almak için dendrit detaylandırılması, merkezi ve periferal sinir sistemlerinin işlev için karmaşık devre esasını kurmak. Nörit gelişimi, sinir sisteminin eleştirel işlevini destekleyen embriyonik gelişim ve nöronal farklılaşma ve neurites bakımı sırasında temel bir rol oynamaktadır. Nöritik işlemleri de nöronal hasar ve rejenerasyon, hem de sinir sistemi bozukluklarında kritik bulunmaktadır. Nöronal mimari çalışma hem normal ve hastalıklı beyin anlamak için çok önemlidir. Neyse ki, fizyolojik olarak ilgili nöronal hücre kültürü sistemleri karmaşık ve heterojen hücre yapıları özetlemek için mevcuttur. Katı deneysel platformlarda, nöronal morfoloji kalitatif ve kantitatif analizleri sağlayacak etkili görselleştirme stratejileri aydınlatılması dayanarak ihtiyaç vardır. Özellikle yararlı olurnanometre ölçeğinde nevritlerle, hem akson ve dendrit görselleştirmek için tutarlı bir platform sağlar ayrıntılı bir metodoloji. Geleneksel elektron mikroskobu gerçek durumundan örneklerinde bozulmalara neden olabilir ki, dehidrasyon ve reçine yerleştirmesi sırasında organik çözücünün kullanılmasını gerektirir. Böylece bulgular 4,9,25 yorumlanmasını sınırlayıcı - Bugüne kadar, nanometre ölçeğinde en fazla yapısal karakterizasyon gibi sert kimyasallara maruz kalan daha büyük hücrelere veya dokulara dayanmaktadır. Ayrıca, elektron ışını penetrasyon için, 1 mikron kesit 12 daha büyük olan bir kalınlık arzeden organizma veya hücre uzantılar için gereklidir. Nihayet, neurites uzatılmış özelliği hantal tanımı yaparak, ayrık dilim özgü veri setleri toplama doku sonuçları kesitli veya öğütülmüş. Hatta cryo-EM için, bir dondurulmuş, hidratlanmış numune kesit mümkün olduğu, yöntem, sıkıştırma artif getirmektedir1, hareket eder. Son yıllarda, araştırmacılar EM ızgaraları ve flaş dondurma sonradan cryo-ET 8,10,18,23 kullanarak nevritlerle görselleştirmek için sıvı etan onları doğrudan hipokampal nöronlar büyümeye nasıl öğrendim. Ancak, bu tür çalışmalar, bir ısmarlama cihaz 10,23, ya da rutin görselleştirme 8,18 için yeterince ince vitreus buz üretmek için kurutma adım eksikliği bilgilerini kullanın ya. Örneğin, bir çalışma EM ızgara 10 lekeleme için 30-40 sn kullanılmasını önerir, ancak bu değer genel kullanım için optimize edilmiş değil ama bu ölçüye dalma-dondurma cihaz için özeldir. Dalma-dondurma örnek öncesinde nem korumak için özel yapılmış bir cihaz yerine piyasada mevcut bir 17 Kullanımı yaygın tekrarlanabilirlik için bir engel teşkil edebilir. Bu çalışmalar Cryo-ET tarafından nevritlerle görselleştirme çığır olsa da, biz ap keşfetmek için bir adım daha almışnöronal numuneler (hipokampal ve dorsal kök ganglion nöronlarının) çeşitli cryo-ET plicability. Ayrıca, optimal ve optimal sonuçları yanı sıra, böyle bir numune için kriyo-ET kullanarak karşılaşabileceği potansiyel eserler hem de tartışmak. Yakın bir yerli devlet korunması ve nanometre ölçeğinde bütün nevritlerle görselleştirmek için detaylı bir teknik tanımlama ultrastrüktürel çalışmalar yürütmek için daha fazla araştırmacılar için yeteneğini geliştirmek olacaktır. Bu amaçla, nevritler görselleştirmek için sabitlenmemiş, boyanmamış nöronlar hazırlamak için ticari olarak temin edilebilen ekipman kullanılarak etkili ve detaylı bir protokol açıklar. Bu sağlıklı neurites ultrastrüktürünü detaylandırma ve yapısal farklılıkları sinir sistemi hastalık modellerinde mevcut ne anlamak için zemin hazırlamaya yönelik önemli bir ilk adımdır. Cryo-ET nanometre ölçeğinde 3-D sabitlenmemiş, boyanmamış nörit özelliklerini çözebilirsiniz yana, yöntem mümkün asla gibi olacaktır yapacaknevritik mimarisini 12 tanımlamak için fore.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="970">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Dumont #7 Tweezers</td>
			<td style="width:196px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:309px;">72803-01</td>
			<td style="width:171px;">For handling EM grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek Corp.</td>
			<td>P35G-1.5-10C</td>
			<td>For growing sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electron microscopy grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Holey Carbon, Au 200, R 2/2</td>
			<td>For growing sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium-free filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1541-055</td>
			<td>For blotting sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large flat point long tweezers</td>
			<td>Excelta Corporation</td>
			<td>E003-000590, 25-SA</td>
			<td>For blotting sample </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vitrification device and tweezers</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Vitrobot Mark III</td>
			<td>For freezing sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini grid storage boxes</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>160-40</td>
			<td>For storing EM grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo transfer holder</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Semi-automated tilt series acquisition software</td>
			<td>SerialEM</td>
			<td>http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image processing software</td>
			<td>IMOD eTomo</td>
			<td>http://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
			<td>For image processing</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Transmission electron microscope for cryoEM</td>
			<td>JEOL, Tokyo</td>
			<td>200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4k x 4k CCD camera</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-D annotation software</td>
			<td>Visage Imaging GmbH</td>
			<td>Amira/Avizo</td>
			<td>For processing 3-D data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Software for digitally stitching 2-D images</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td>For processing 2-D data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-118</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B-0252</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium tetraborate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B-9876</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-lysine </td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2636-500MG</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter system</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430758</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-27 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant rat b-NGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>556-NG</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3003-5G</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5&#39;-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503-100MG</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of primary neurons for visualizing neurites in a frozen-hydrated state using cryo-electron tomography

Nöritler, hem dendrit ve aksonlar, nöronlar arasındaki elektriksel uyarıların iletimini sağlayacak nöronal hücresel süreçleri vardır. Neurites yapısının tanımlanması, bu işlemler, sinaptik iletişim destek malzemeleri ve sinyalleri nasıl hareket anlamak için çok önemlidir. Elektron mikroskopisi (EM) geleneksel nevritlerin içindeki ultrastrüktürel özellikleri değerlendirmek için kullanılmıştır, ancak dehidrasyon ve reçine yerleştirmesi sırasında organik çözücüye maruz kalma yapıları bozabilmektedir. Önemli bir karşılanmamış hedefi böyle eserler etkilenmez yapısal değerlendirmeler için izin prosedürlerin oluşturulmasıdır. Burada, biz büyüyen ve kriyo-elektron tomografisi (kriyo-ET) ile muayene ile takip elektron mikroskobu ızgaraları farklı primer nöronlar flaş dondurma bütün nevrotiler için detaylı ve tekrarlanabilir bir protokol kurduk. Bu teknik asse kolaylaştıran, nanometre çözünürlükte donmuş, hidratlı neurites 3-D görselleştirme sağlarmorfolojik farklılıklar ssment. Bizim protokol dorsal kök ganglion (DRG) nevritler ve onların yakın yerli devlet hipokampal neurites bir görselleştirme görülmemiş bir görünüm verir. Gibi, bu yöntemlerin normal nöronlar ve nörolojik bozukluklar etkilenenlerin hem neurites gelecek çalışmalar için bir temel oluşturabilir.

Önceki cryo-ET ile dondurma ve görüntüleme için, ışık mikroskobu ve görüntüler nöronlar üzerinde büyüdüğü EM ızgaranın alınmalıdır. Nöritler birbirleri ile önemli örtüşme olmaksızın açıkça görünür olmalıdır. Şekil 3A&#39;da renkli bir kutu büyütüldüğünde nevrotiler ızgara kafes boyunca uzandığı Şekil 3B, daha yüksek büyütme göstermek için bir alanı temsil eder. Her ızgara-kare nöronlar ve onların nevritlerle destekleyen bir hole...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography at JoVE.com

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Ince yapı analizi için nöronal işlemleri korumak için, camsı bir buz tabakası içinde süspansiyon haline numune verecek şekilde flaş dondurma, ardından elektron mikroskobu taramalarında primer nöron kaplanması için bir protokol açıklar. Bu örnekler nanometre ölçeğinde yapıları görselleştirmek için bir kriyo-elektron mikroskobu ile muayene edilebilir.

Cryo-Elektron Tomografi kullanma Frozen-hidratlı Devlette neurites görselleştirme İlköğretim Nöronlar hazırlanması

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

FM Boyalar Kültür Serebellar Granül Nöronlar Synaptic veziküllü Havuzu Yenileme Kantitatif Analiz

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograd Floresan Etiketleme Belirlenen Nöronlar gelen Hedefli Hücre dışı Tek ünitesi Kayıt izin verir<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

Hazırlanması<em&gt; Drosophila</emIçin&gt; Orta Nöronlar<em&gt; In situ</em&gt; Patch Sıkma

Short generation times and facile genetic techniques make the fruit fly Drosophila melanogaster an excellent genetic model in fundamental neuroscience ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Primer hipokampal nöronlar kalsiyum fosfat transfeksiyonu

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Yapısal Aydınlatma Mikroskobu kullanılarak Rat İlköğretim hipokampalinden Dentritik Spine görüntüleme

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Fare dopaminerjik nöronlar İlköğretim Kültür

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Bir<em&gt; İn Vitro</emKas afferentlerin tahrik Properties incelenmesi için&gt; Yetişkin Fare kas-sinir Hazırlık

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Measuring Connectivity in the Primary Visual Pathway in Human Albinism Using Diffusion Tensor Imaging and Tractography

Difüzyon tensör görüntüleme ve traktografi kullanarak İnsan Albinizmi İlköğretim Görsel Yolu&#39;ndaki Bağlantı Ölçme

In albinism, the number of ipsilaterally projecting retinal ganglion cells (RGCs) is significantly reduced. The retina and optic chiasm have been proposed ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modelleme nöronal ölüm ve fare birincil serebellar granül nöronlar dejenerasyon

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

GLUT4 protein Deconvolution mikroskobu kullanarak fare birincil hipotalamik nöronlarda ticareti canlı görüntüleri

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...