Name: a sensitive and specific quantitation method for determination of serum cardiac myosin binding protein-c by electrochemiluminescence immunoassay
Uploaded: 2013-08-08T11:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay at JoVE.com

Deze studie werd gefinancierd door de National Institutes of Health beurzen R01HL105826 en K02HL114749 (Dr Sadayappan), en de American Heart Association Midwest Fellowships; 11PRE7240022 (Mr Barefield) en 13POST14720024 (Dr Govindan). De auteurs zeer erkentelijk voor de hulp van Dr Jimmy Page, Jill Clampit en Dr John Hudson, MSD, voor hun uitstekende technische en literatuur ondersteuning bij de ontwikkeling van de test.

1. Uniplex cMyBP-C Assay <ol><li> De dag voor het experiment, de vacht van de 96-well MSD kale standaard plaat met invangantilichaam. Voor cMyBP-C is een 30 gl volume van muizen monoklonaal anti-cMyBP-C-antilichaam (gelatinevrije) bij een concentratie van 5 ug / ml verdund in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). </li><li> Omdat het goed is hydrofoob, pipet de oplossing in de rechter benedenhoek van de put; tik op de zijkanten van de plaat aan de oplossing over de gehele goed verspreid. </li><li> De plaat is bedekt ...

<ol>
	<li>Thygesen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Third+universal+definition+of+myocardial+infarction.">Third universal definition of myocardial infarction.</a> Eur. Heart J. 33, 2551-2567 (2012).</li><li>Leng, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELISA+and+multiplex+technologies+for+cytokine+measurement+in+inflammation+and+aging+research.">ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research.</a> J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 63, 879-884 (2008).</li><li>Thompson, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+electrochemiluminescence+wash+and+no-wash+immunoassays+for+detection+of+serum+antibodies+to+smooth+Brucella+strains.">Competitive electrochemiluminescence wash and no-wash immunoassays for detection of serum antibodies to smooth Brucella strains.</a> Clin. Vaccine Immunol. 16, 765-771 (2009).</li><li>Kingsmore, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+measurement:+technologies+and+applications+of+protein+and+antibody+arrays.">Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 5, 310-320 (2006).</li><li>Altan, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long-acting+tumor+necrosis+factor+alpha-binding+protein+demonstrates+activity+in+both+in+vitro+and+in+vivo+models+of+endometriosis.">A long-acting tumor necrosis factor alpha-binding protein demonstrates activity in both in vitro and in vivo models of endometriosis.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 334, 460-466 (2010).</li><li>Patel, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+cytokine+detection+in+acute+coronary+syndrome+reveals+up-regulation+of+interferon+gamma+and+interleukin-10+post+myocardial+infarction.">High sensitivity cytokine detection in acute coronary syndrome reveals up-regulation of interferon gamma and interleukin-10 post myocardial infarction.</a> Clin. Immunol. 133, 251-256 (2009).</li><li>Fu, Q., Zhu, J., Van Eyk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+multiplex+immunoassay+platforms.">Comparison of multiplex immunoassay platforms.</a> Clin. Chem. 56, 314-318 (2010).</li><li>Mahajan, V. S., Jarolim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+interpret+elevated+cardiac+troponin+levels.">How to interpret elevated cardiac troponin levels.</a> Circulation. 124, 2350-2354 (2011).</li><li>Govindan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myosin+binding+protein-C+is+a+potential+diagnostic+biomarker+for+myocardial+infarction.">Cardiac myosin binding protein-C is a potential diagnostic biomarker for myocardial infarction.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 52, 154-164 (2012).</li><li>Barefield, D., Sadayappan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+and+function+of+cardiac+myosin+binding+protein-C+in+health+and+disease.">Phosphorylation and function of cardiac myosin binding protein-C in health and disease.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 48, 866-875 (2010).</li><li>Kuster, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myosin+binding+protein+C+phosphorylation+in+cardiac+disease.">Cardiac myosin binding protein C phosphorylation in cardiac disease.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 43-52 (2012).</li><li>Sadayappan, S., de Tombe, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myosin+binding+protein-C:+redefining+its+structure+and+function.">Cardiac myosin binding protein-C: redefining its structure and function.</a> Biophys. Rev. 4, 93-106 (2012).</li><li>Sadayappan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myosin+binding+protein-C:+a+potential+early-stage,+cardiac-specific+biomarker+of+ischemia-reperfusion+injury.">Cardiac myosin binding protein-C: a potential early-stage, cardiac-specific biomarker of ischemia-reperfusion injury.</a> Biomark Med. 6, 69-72 (2012).</li><li>Fichorova, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+technical+variables+affecting+immunoassay+recovery+of+cytokines+from+human+serum+and+simulated+vaginal+fluid:+a+multicenter+study.">Biological and technical variables affecting immunoassay recovery of cytokines from human serum and simulated vaginal fluid: a multicenter study.</a> Anal. Chem. 80, 4741-4751 (2008).</li><li>Malekzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+multi-plex+and+mono-plex+platforms+for+the+discovery+of+inflammatory+profiles+in+neurodegenerative+diseases.">Challenges in multi-plex and mono-plex platforms for the discovery of inflammatory profiles in neurodegenerative diseases.</a> Methods. 56, 508-513 (2012).</li></ol>

In deze studie tonen we de toepassing van een multiplex immunoassay voor de detectie van meerdere cardiale biomarkers in serum van patiënten. Deze techniek heeft vele voordelen ten opzichte van traditionele ELISA. Eerst ECL in de testkit wordt gebruikt in plaats van colorimetrische detectie. In ECL, een elektrisch signaal stimuleert de lokale productie van de gemeten eigenschap (licht), waardoor het ontkoppelen van de stimulatie gebeurtenis het signaal, waarbij die 14 vermindert. Dit maakt hoge gevoeligheid,...

Het meten van lage hoeveelheden eiwit in complexe biologische monsters, zoals serum, wordt steeds klinisch belang voor patiëntbehandeling, alsmede fundamentele wetenschap. Bijvoorbeeld, een de serumniveaus van cardiale biomarkers, zoals troponine I, in een klinische setting is met acuut myocardiaal infarct (MI) 1. Om eiwitten in serummonsters detecteren standaard enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is de meest gebruikte techniek omdat het hogere gevoeligheid en maakt absolute kwantificering van de analyt. Echter, traditionele ELISA een betrekkelijk grote hoeveelheid monster (meestal 100 pl), hoge achtergrondsignaal in sommige biologische vloeistoffen, en zijn beperkt tot het meten van slechts een analyt per ELISA 2. Onlangs werd een nieuwe immunoassay techniek leidt dat veel van deze nadelen omzeilt. Deze gemodificeerde test, ontwikkeld door MSD, gebruikt electrochemiluminesclingen (ECL) voor signaaldetectie, die zorgt voor een zeer lage achtergrond en een verhoogde gevoeligheid, waardoor het gebruik van kleine monstervolumes. Electrochemiluminescence is gebaseerd op het reportermolecuul ruthenium (II) trisbipyridal, die is bevestigd aan de detectie-antilichamen. Het reportermolecuul zendt licht bij 620 nm van de elektrische stimulatie van de bodem van de 96-well plaat die koolstof elektroden geïntegreerd in deze 3 heeft. Ook, door spot coating, verschillende capture antilichamen kunnen worden aangebracht in een putje (tot 10 op een 96-well plaat), waardoor gelijktijdige kwantificering van verschillende eiwitten in een monster 4. Deze techniek Onlangs is een pro-inflammatoire cytokine profielen 5,6 serum meten. De multiplex platen van MSD gunstig in vergelijking met andere multiplex assay platformen 7. Met behulp van MSD als de primaire-test platform, hebben we verder een op maat gemaakte 3-plex plaat ontwikkeld dat cEen gelijktijdig kwantificeren van het niveau van cardiale myosine bindend eiwit C (cMyBP-C), creatine-kinase MB (CK-MB) en cardiaal troponine I (cTnI) en de resultaten werden vergeleken met monoplex detectie van cMyBP-C. CK-MB en troponine zijn gevestigde biomarkers voor MI. Echter, toename van deze biomarkers worden veroorzaakt door andere dan MI pathologieën, zoals myocarditis of nierfalen 8. Dit pleit voor het toevoegen van extra biomarkers om de specificiteit van de MI diagnose te verhogen. We hebben onlangs aangetoond dat cMyBP-C is ook een potentiële biomarker voor MI 9. cMyBP-C is een dikke filament geassocieerd eiwit dat tot expressie gebracht in het hart, 10-12 maar niet in skeletspieren en gladde spieren. Dus het verhoogde niveau van cMyBP-C in de bloedsomloop is een specifieke indicator van hartschade 13. In deze studie vergeleken we Uniplex detectie van cMyBP-C met behulp van een aangepaste 3-plex assay voor serumniveaus van metencMyBP-C, CK-MB en troponine in het serum van patiënten met MI. In de toekomst zou deze handtekening techniek worden gebruikt om MI te diagnosticeren bij patiënten met pijn op de borst in de spoedafdeling. De instelling Review Board (IRB) van de Loyola University Chicago ingestemd met de studie voor het gebruik van deidentified menselijke populaties en het gebruik van de immunoassay (LU # 20392).

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>R92TC-2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Acros</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Blocker A</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>R93BA-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10X</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP399-4</td>
			<td>Filter before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-137180L</td>
			<td>For coating, antibody has to be gelatin free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plates and Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Array 96-well standard plate</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>L15XA-3</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>N452A-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermaSeal Sealing Film</td>
			<td>Life Science Products Inc.</td>
			<td>ST-3098</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD SECTOR Imager 2400A</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS 2/4 digital microtiter shaker</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3208001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a sensitive and specific quantitation method for determination of serum cardiac myosin binding protein-c by electrochemiluminescence immunoassay

Biomarkers worden steeds belangrijker in de klinische besluitvorming, evenals fundamentele wetenschap. Diagnose van myocardiaal infarct (MI) wordt grotendeels bepaald door het detecteren van cardiaal-specifieke eiwitten in serum of plasma van patiënten als indicator van myocardiale schade. Onlangs hebben aangetoond dat cardiale myosine bindend eiwit C (cMyBP-C) detecteerbaar is in het serum na MI, hebben we voorgesteld als potentiële biomarker voor MI. Biomarkers worden typisch gedetecteerd door traditionele sandwich enzyme-linked immunosorbent assays. Deze techniek vereist een groot monstervolume, een klein dynamisch bereik, en kan slechts een eiwit meten tegelijk. Hier laten we een multiplex immunoassay waarbij drie cardiale eiwitten gelijktijdig worden gemeten met een hoge gevoeligheid. Meten cMyBP-C in Uniplex of samen met creatine kinase MB en troponine I toonde vergelijkbare gevoeligheid. Deze techniek maakt gebruik van de Meso Scale Discovery(MSD) methode van multiplexen in een 96-wells plaat in combinatie met electrochemiluminescence voor detectie. Terwijl slechts kleine steekproef volumes nodig zijn, worden hoge gevoeligheid en een groot dynamisch bereik gerealiseerd. Met deze techniek, hebben we gemeten cMyBP-C, creatine kinase MB, en cardiale troponine I niveau in het serum monsters van 16 patiënten met MI en vergeleken de resultaten met 16 controlepersonen. We waren in staat om alle drie de markers te detecteren in deze monsters en vond alle drie biomarkers worden verhoogd na MI. Deze techniek is daarom geschikt voor de gevoelige detectie van cardiale biomarkers in serummonsters.

De basisprincipes en workflow van de 3-plex assay worden getoond in figuur 1, en ​​de algehele werkstroom wordt beschreven in Tabel 1. Uniplex assays werken volgens hetzelfde principe, behalve dat de gehele onderkant goed bekleed met een capture-antilichaam. Signaaldetectie uitgevoerd door ECL waarbij een elektrisch signaal wordt toegevoerd aan de bodem van de put. Dit op zijn beurt, initieert een lokale productie van licht door een chemische reactie van de lees-buffer met SULFO TAG...

Watch this Scientific Journal Video about A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay at JoVE.com

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Het meten van biomarkers in complexe biologische monsters wordt in toenemende mate leidend klinische besluitvorming. We beschrijven een zeer gevoelige methode voor het gelijktijdig meten cardiale myosine bindend eiwit C, creatine kinase MB, troponine I en in serummonsters van patiënten met myocardiaal infarct en gezonde controlepersonen.

Een gevoelige en specifieke kwantificering Methode voor het bepalen van Serum cardiale myosine bindend eiwit C door elektrochemiluminescentie-Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

Research

JoVE Journal

Biology

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

PAR-Clip - een methode om Transcriptome-breed de bindingsplaatsen van RNA-bindende eiwitten te identificeren

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Een methode voor muis eilandjes van Langerhans Isolatie en intracellulaire cAMP Bepaling

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

Intravitale Microscopie van de microcirculatie in de Muis cremasterspier voor de Analyse van de perifere stamcelmigratie

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Eiwitzuivering-vrij bindwijze affiniteit Bepaling door Microschaal thermophoresis

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

Een snelle en specifieke Microplate Assay voor de bepaling van de intra-en extracellulaire ascorbaat in gekweekte cellen

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Een strategie voor de gevoelige, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

qPCR is een gevoelige en snelle methode voor de detectie van Cytomegaloviral DNA in formaline gefixeerde, paraffine-ingebedde biopsieweefsel

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

Zeer efficiënte Ligatie van Kleine RNA-moleculen voor MicroRNA Kwantificering van High-throughput sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Kwantificering van endotheelcellen Hechtvermogen<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...