Name: a sensitive and specific quantitation method for determination of serum cardiac myosin binding protein-c by electrochemiluminescence immunoassay
Uploaded: 2013-08-08T11:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay at JoVE.com

Cette étude a été financée par le National Institutes of Health des subventions R01HL105826 et K02HL114749 (Dr. Sadayappan) et américaines Bourses Midwest Heart Association; 11PRE7240022 (M. Barefield) et 13POST14720024 (Dr. Govindan). Les auteurs remercient l&#39;aide du Dr. Jimmy Page, Jill Clampit et le Dr John Hudson, MSD, pour leur excellent soutien technique et de la littérature dans le développement du dosage.

1. Uniplex cMyBP-C Assay <ol><li> La veille de l&#39;expérience, manteau de la plaque standard nu 96 puits MSD avec l&#39;anticorps de capture. Pour cMyBP-C, utiliser un volume 30 ul d&#39;anticorps anti-cMyBP-C monoclonal de souris (sans gélatine) à une concentration de 5 ug / ml dilué dans un tampon phosphate salin (PBS). </li><li> Comme le puits est hydrophobe, une pipette de la solution dans le coin inférieur du puits; puis sur les côtés de la plaque pour propager la solution sur l&#39;ensemble de puits. </...

<ol>
	<li>Thygesen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Third+universal+definition+of+myocardial+infarction.">Third universal definition of myocardial infarction.</a> Eur. Heart J. 33, 2551-2567 (2012).</li><li>Leng, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELISA+and+multiplex+technologies+for+cytokine+measurement+in+inflammation+and+aging+research.">ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research.</a> J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 63, 879-884 (2008).</li><li>Thompson, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+electrochemiluminescence+wash+and+no-wash+immunoassays+for+detection+of+serum+antibodies+to+smooth+Brucella+strains.">Competitive electrochemiluminescence wash and no-wash immunoassays for detection of serum antibodies to smooth Brucella strains.</a> Clin. Vaccine Immunol. 16, 765-771 (2009).</li><li>Kingsmore, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+measurement:+technologies+and+applications+of+protein+and+antibody+arrays.">Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 5, 310-320 (2006).</li><li>Altan, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long-acting+tumor+necrosis+factor+alpha-binding+protein+demonstrates+activity+in+both+in+vitro+and+in+vivo+models+of+endometriosis.">A long-acting tumor necrosis factor alpha-binding protein demonstrates activity in both in vitro and in vivo models of endometriosis.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 334, 460-466 (2010).</li><li>Patel, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+cytokine+detection+in+acute+coronary+syndrome+reveals+up-regulation+of+interferon+gamma+and+interleukin-10+post+myocardial+infarction.">High sensitivity cytokine detection in acute coronary syndrome reveals up-regulation of interferon gamma and interleukin-10 post myocardial infarction.</a> Clin. Immunol. 133, 251-256 (2009).</li><li>Fu, Q., Zhu, J., Van Eyk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+multiplex+immunoassay+platforms.">Comparison of multiplex immunoassay platforms.</a> Clin. Chem. 56, 314-318 (2010).</li><li>Mahajan, V. S., Jarolim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+interpret+elevated+cardiac+troponin+levels.">How to interpret elevated cardiac troponin levels.</a> Circulation. 124, 2350-2354 (2011).</li><li>Govindan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myosin+binding+protein-C+is+a+potential+diagnostic+biomarker+for+myocardial+infarction.">Cardiac myosin binding protein-C is a potential diagnostic biomarker for myocardial infarction.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 52, 154-164 (2012).</li><li>Barefield, D., Sadayappan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+and+function+of+cardiac+myosin+binding+protein-C+in+health+and+disease.">Phosphorylation and function of cardiac myosin binding protein-C in health and disease.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 48, 866-875 (2010).</li><li>Kuster, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myosin+binding+protein+C+phosphorylation+in+cardiac+disease.">Cardiac myosin binding protein C phosphorylation in cardiac disease.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 43-52 (2012).</li><li>Sadayappan, S., de Tombe, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myosin+binding+protein-C:+redefining+its+structure+and+function.">Cardiac myosin binding protein-C: redefining its structure and function.</a> Biophys. Rev. 4, 93-106 (2012).</li><li>Sadayappan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myosin+binding+protein-C:+a+potential+early-stage,+cardiac-specific+biomarker+of+ischemia-reperfusion+injury.">Cardiac myosin binding protein-C: a potential early-stage, cardiac-specific biomarker of ischemia-reperfusion injury.</a> Biomark Med. 6, 69-72 (2012).</li><li>Fichorova, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+technical+variables+affecting+immunoassay+recovery+of+cytokines+from+human+serum+and+simulated+vaginal+fluid:+a+multicenter+study.">Biological and technical variables affecting immunoassay recovery of cytokines from human serum and simulated vaginal fluid: a multicenter study.</a> Anal. Chem. 80, 4741-4751 (2008).</li><li>Malekzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+multi-plex+and+mono-plex+platforms+for+the+discovery+of+inflammatory+profiles+in+neurodegenerative+diseases.">Challenges in multi-plex and mono-plex platforms for the discovery of inflammatory profiles in neurodegenerative diseases.</a> Methods. 56, 508-513 (2012).</li></ol>

Dans cette étude, nous montrons l&#39;applicabilité d&#39;un test immunologique multiplex pour la détection de multiples biomarqueurs cardiaques dans le sérum de patients. Cette technique présente de nombreux avantages par rapport ELISA classique. Tout d&#39;abord, ECL dans le kit de dosage est utilisé à la place de la détection colorimétrique. En ECL, un signal électrique stimule la production locale de la propriété mesurée (lumière), ainsi découpler l&#39;événement de stimulation du signal, ce qui ré...

La mesure de faibles quantités de protéines dans des échantillons biologiques complexes comme le sérum, est d&#39;une importance croissante pour la gestion clinique des patients, ainsi que la science fondamentale. Par exemple, une augmentation des taux sériques de biomarqueurs cardiaques, tels que la troponine I, dans un contexte clinique est compatible avec infarctus aigu du myocarde (MI) 1. Pour détecter les protéines dans des échantillons de sérum, le dosage immuno-enzymatique standard (ELISA) est la technique la plus souvent utilisée car elle a une sensibilité élevée et permet une quantification absolue de l&#39;analyte. Toutefois, les tests ELISA traditionnelles exigent une quantité relativement importante de l&#39;échantillon (typiquement 100 pi), avoir un signal de fond élevé dans certains liquides biologiques, et sont limités à la mesure d&#39;un seul analyte par ELISA 2. Récemment, une nouvelle technique de dosage immunologique a été introduit qui contourne la plupart de ces inconvénients. Ce test modifié, développé par MSD, utilise electrochemiluminescrence (ECL) pour la détection des signaux, ce qui permet pour un fond très faible et d&#39;une sensibilité accrue, ce qui permet l&#39;utilisation de petits volumes d&#39;échantillons. Électrochimioluminescence est basé sur la molécule rapporteur du ruthénium (II) trisbipyridal, qui est fixé à l&#39;anticorps de détection. Cette molécule rapporteur émet de la lumière à 620 nm lors de la stimulation électrique du bas de la plaque à 96 puits, qui comporte des électrodes de carbone intégrées dans les trois. En outre, en utilisant un revêtement par points, plusieurs anticorps de capture peuvent être enrobés dans un puits (jusqu&#39;à 10 sur une plaque 96 puits), ce qui permet, pour la quantification simultanée de plusieurs protéines dans un échantillon unique 4. Cette technique a été utilisée récemment pour mesurer les profils de cytokines pro-inflammatoires dans le sérum 5,6. Les plaques de multiplex de MSD se comparent favorablement à d&#39;autres plates-formes de dosage multiplex 7. Utilisation de MSD en tant que plateforme d&#39;analyse primaire, nous avons encore développé une coutume fait plaque 3-plex qui cune quantifier simultanément le niveau de la myosine cardiaque protéine de liaison-C (cMyBP-C), la créatine kinase MB (CK-MB) et la troponine I cardiaque (cTnI), et les résultats ont été comparés avec détection monoplex de cMyBP-C. CK-MB et troponine Ic sont des biomarqueurs bien établies pour MI. Cependant, les augmentations de ces biomarqueurs peuvent être causés par des pathologies autres que MI, par exemple, une myocardite ou une insuffisance rénale 8. Ceci plaide pour l&#39;ajout de biomarqueurs supplémentaires pour augmenter la spécificité du diagnostic MI. Nous avons récemment montré que cMyBP-C est également un biomarqueur potentiel de MI 9. cMyBP-C est une protéine associée à filament épais qui est exprimé dans le cœur, 10-12, mais pas dans les muscles squelettiques ou lisse. Ainsi, l&#39;augmentation du niveau de cMyBP-C dans le système circulatoire est un indicateur spécifique de lésions cardiaques 13. Dans cette étude, nous avons comparé la détection Uniplex de cMyBP-C avec l&#39;utilisation d&#39;un test 3-plex coutume de mesurer les taux sériques decMyBP-C, CK-MB et troponine Ic dans le sérum des patients atteints d&#39;infarctus du myocarde. Dans l&#39;avenir, cette technique de signature peut être utilisée pour diagnostiquer IM chez les patients présentant des douleurs à la poitrine dans la salle d&#39;urgence. La commission d&#39;examen institution (IRB) de l&#39;Université Loyola de Chicago a approuvé l&#39;étude pour l&#39;utilisation des échantillons humains rendues anonymes et l&#39;utilisation de l&#39;immuno-essai (LU # 20392).

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>R92TC-2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Acros</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Blocker A</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>R93BA-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10X</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP399-4</td>
			<td>Filter before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-137180L</td>
			<td>For coating, antibody has to be gelatin free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plates and Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Array 96-well standard plate</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>L15XA-3</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>N452A-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermaSeal Sealing Film</td>
			<td>Life Science Products Inc.</td>
			<td>ST-3098</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD SECTOR Imager 2400A</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS 2/4 digital microtiter shaker</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3208001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a sensitive and specific quantitation method for determination of serum cardiac myosin binding protein-c by electrochemiluminescence immunoassay

Les biomarqueurs sont de plus en plus en plus important dans la prise de décision clinique, ainsi que la science fondamentale. Diagnostic de l&#39;infarctus du myocarde (IM) est en grande partie entraînée par la détection de protéines spécifiquement cardiaque dans le sérum ou le plasma de patients comme indicateur de la lésion du myocarde. Ayant récemment montré que la myosine cardiaque protéine de liaison-C (cMyBP-C) est détectable dans le sérum après un IM, nous avons proposé comme un biomarqueur potentiel de MI. Les biomarqueurs sont généralement détectés par alternance enzyme-linked tests immuno traditionnels. Toutefois, cette technique nécessite un grand volume de l&#39;échantillon, a une faible plage dynamique, et permet de mesurer une seule protéine à la fois. Ici, nous montrons un test immunologique multiplex dans lequel trois protéines cardiaques peuvent être mesurés simultanément avec une grande sensibilité. Mesure cMyBP-C dans Uniplex ou avec de créatine kinase MB et la troponine I cardiaque ont montré une sensibilité comparable. Cette technique utilise la méso échelle Discovery(MSD) méthode de multiplexage dans une plaque de 96 puits combiné avec électrochimiluminescence pour la détection. Bien que de petites quantités d&#39;échantillons sont nécessaires, une grande sensibilité et une grande plage dynamique sont atteints. Grâce à cette technique, nous avons mesuré cMyBP-C, la créatine kinase MB et la troponine cardiaque niveaux I dans des échantillons de sérum de 16 sujets atteints d&#39;IM et comparé les résultats avec 16 sujets témoins. Nous avons pu détecter tous les trois marqueurs dans ces échantillons et découvert les trois biomarqueurs être augmentée après MI. Cette technique est donc adapté à la détection sensible des biomarqueurs cardiaques dans des échantillons de sérum.

Les principes de base et le workflow de l&#39;essai 3-plex sont présentés dans la figure 1, et le flux de travail global est décrite dans le tableau 1. Dosages Uniplex travaillent sur le même principe sauf que l&#39;ensemble de fond de puits est recouvert d&#39;un anticorps de capture. la détection du signal est effectuée par ECL dans lequel un signal électrique est appliqué à la partie inférieure du puits. Ceci, en retour, initie une production locale de la lumière à traver...

Watch this Scientific Journal Video about A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay at JoVE.com

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Biomarqueurs de mesure dans des échantillons biologiques complexes est de plus en plus guident prise de décision clinique. Nous décrivons une méthode très sensible pour mesurer simultanément la myosine cardiaque protéine de liaison-C, la créatine kinase MB et la troponine I cardiaque dans le sérum de sujets atteints d&#39;infarctus du myocarde et de sujets témoins en bonne santé.

Une méthode de quantification sensible et spécifique pour la détermination de sérum myosine cardiaque Binding Protein-C par immuno-Electrochemiluminescence

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

Research

JoVE Journal

Biology

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

PAR-Clip - Une méthode pour identifier transcriptome à l&#39;échelle des sites de liaison des protéines liant l&#39;ARN

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Recherche

Biologie

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Une méthode pour la souris Isolement îlots pancréatiques et AMPc intracellulaire Détermination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

Microscopie intravitale de la microcirculation dans le muscle de souris Cremaster pour l&#39;analyse des souches périphériques migration cellulaire

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Protein Purification méthode sans la détermination de l&#39;affinité de liaison par thermophorèse Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

Une microplaque de dosage rapide et spécifique pour la détermination de l&#39;ascorbate intra-et extracellulaire dans les cellules cultivées

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Une stratégie pour sensibles à grande échelle quantitatives métabolomique

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

qPCR est une méthode sensible et rapide pour la détection de l&#39;ADN cytomégalovirus dans la formaline fixe, inclus dans la paraffine des tissus de biopsie

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

La ligature très efficace de petites molécules d&#39;ARN pour microARN quantification par séquençage à haut débit

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

La quantification des cellules endothéliales adhésivité<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...