Name: a sensitive and specific quantitation method for determination of serum cardiac myosin binding protein-c by electrochemiluminescence immunoassay
Uploaded: 2013-08-08T11:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay at JoVE.com

מחקר זה מומן על ידי מכונים הלאומי לבריאות מענקים R01HL105826 וK02HL114749 (ד&quot;ר Sadayappan), ומלגות לאיגוד לב אמריקאי במערב התיכון; 11PRE7240022 (מר Barefield) ו13POST14720024 (ד&quot;ר Govindan). המחברים תודה להכיר בסיועו של ד&quot;ר ג&#39;ימי פייג&#39;, ג&#39;יל Clampit וד&quot;ר ג&#39;ון הדסון, MSD, לתמיכה הטכנית ובספרות מצוינת שלהם בפיתוח assay.

1. Assay cMyBP-C Uniplex <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום שלפני הניסוי, מעיל הצלחת הסטנדרטית החשופה 96, גם MSD עם נוגדן ללכוד. לcMyBP-C, יש להשתמש בנפח של 30 μl עכבר נוגדן אנטי cMyBP-C חד שבטי (ג&#39;לטין חינם) בריכוז של 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​מדולל בופר פוספט (PBS). </li><li style=";tex...

<ol>
	<li>Thygesen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Third+universal+definition+of+myocardial+infarction.">Third universal definition of myocardial infarction.</a> Eur. Heart J. 33, 2551-2567 (2012).</li><li>Leng, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELISA+and+multiplex+technologies+for+cytokine+measurement+in+inflammation+and+aging+research.">ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research.</a> J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 63, 879-884 (2008).</li><li>Thompson, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+electrochemiluminescence+wash+and+no-wash+immunoassays+for+detection+of+serum+antibodies+to+smooth+Brucella+strains.">Competitive electrochemiluminescence wash and no-wash immunoassays for detection of serum antibodies to smooth Brucella strains.</a> Clin. Vaccine Immunol. 16, 765-771 (2009).</li><li>Kingsmore, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+measurement:+technologies+and+applications+of+protein+and+antibody+arrays.">Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 5, 310-320 (2006).</li><li>Altan, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long-acting+tumor+necrosis+factor+alpha-binding+protein+demonstrates+activity+in+both+in+vitro+and+in+vivo+models+of+endometriosis.">A long-acting tumor necrosis factor alpha-binding protein demonstrates activity in both in vitro and in vivo models of endometriosis.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 334, 460-466 (2010).</li><li>Patel, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+cytokine+detection+in+acute+coronary+syndrome+reveals+up-regulation+of+interferon+gamma+and+interleukin-10+post+myocardial+infarction.">High sensitivity cytokine detection in acute coronary syndrome reveals up-regulation of interferon gamma and interleukin-10 post myocardial infarction.</a> Clin. Immunol. 133, 251-256 (2009).</li><li>Fu, Q., Zhu, J., Van Eyk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+multiplex+immunoassay+platforms.">Comparison of multiplex immunoassay platforms.</a> Clin. Chem. 56, 314-318 (2010).</li><li>Mahajan, V. S., Jarolim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+interpret+elevated+cardiac+troponin+levels.">How to interpret elevated cardiac troponin levels.</a> Circulation. 124, 2350-2354 (2011).</li><li>Govindan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myosin+binding+protein-C+is+a+potential+diagnostic+biomarker+for+myocardial+infarction.">Cardiac myosin binding protein-C is a potential diagnostic biomarker for myocardial infarction.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 52, 154-164 (2012).</li><li>Barefield, D., Sadayappan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+and+function+of+cardiac+myosin+binding+protein-C+in+health+and+disease.">Phosphorylation and function of cardiac myosin binding protein-C in health and disease.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 48, 866-875 (2010).</li><li>Kuster, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myosin+binding+protein+C+phosphorylation+in+cardiac+disease.">Cardiac myosin binding protein C phosphorylation in cardiac disease.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 43-52 (2012).</li><li>Sadayappan, S., de Tombe, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myosin+binding+protein-C:+redefining+its+structure+and+function.">Cardiac myosin binding protein-C: redefining its structure and function.</a> Biophys. Rev. 4, 93-106 (2012).</li><li>Sadayappan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myosin+binding+protein-C:+a+potential+early-stage,+cardiac-specific+biomarker+of+ischemia-reperfusion+injury.">Cardiac myosin binding protein-C: a potential early-stage, cardiac-specific biomarker of ischemia-reperfusion injury.</a> Biomark Med. 6, 69-72 (2012).</li><li>Fichorova, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+technical+variables+affecting+immunoassay+recovery+of+cytokines+from+human+serum+and+simulated+vaginal+fluid:+a+multicenter+study.">Biological and technical variables affecting immunoassay recovery of cytokines from human serum and simulated vaginal fluid: a multicenter study.</a> Anal. Chem. 80, 4741-4751 (2008).</li><li>Malekzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+multi-plex+and+mono-plex+platforms+for+the+discovery+of+inflammatory+profiles+in+neurodegenerative+diseases.">Challenges in multi-plex and mono-plex platforms for the discovery of inflammatory profiles in neurodegenerative diseases.</a> Methods. 56, 508-513 (2012).</li></ol>

במחקר זה, אנו מציגים את הישימות של immunoassay זמנית לגילוי של סמנים ביולוגיים בסרום לב מרובים מחולים. טכניקה זו יש יתרונות רבים על פני ELISA המסורתי. ראשית, ECL בערכת assay משמש במקום זיהוי colorimetric. בECL, אות חשמלי מגרה את הייצור המקומי של הנכס נמדד (אור), ובכך שחרר את סוגר אירוע הגיר?...

המדידה של כמויות נמוכות של חלבון בדגימות ביולוגיות מורכבות, כגון סרום, היא בעלת חשיבות קלינית גוברת לניהול מטופל, כמו גם מדע בסיסי. לדוגמה, עלייה ברמות בסרום של סמנים ביולוגיים לב, כמו טרופונין I, בהגדרה קלינית היא בקנה אחד עם אוטם שריר הלב (MI) 1. כדי לזהות חלבונים בדגימות סרום, assay immunosorbent אנזים צמוד הסטנדרטי (ELISA) הוא הטכניקה משמשת לרוב כיש לו רגישות גבוהה ומאפשר לכימות מוחלטת של אנליטי. עם זאת, ELISAs המסורתי דורש כמות גדולה יחסית של מדגם (בדרך כלל 100 μl), יש לי אות רקע גבוהה בחלק מהנוזלים ביולוגיים, והם מוגבלים למדידת אחת בלבד אנליטי לELISA 2. לאחרונה, טכניקת immunoassay חדשה הוצגה שעוקפת רבים מחסרונות אלה. assay שונה זו, שפותח על ידי MSD, משתמש electrochemiluminescence (ECL) לזיהוי אות, אשר מאפשר רקע נמוך מאוד ורגישות מוגברת, מה שמאפשר שימוש בכרכי מדגם קטן. Electrochemiluminescence מבוסס על כתב מולקולת רותניום (השני) trisbipyridal, אשר מצורף לנוגדנים לזיהוי. מולקולת הכתב הזה פולט אור ב620 ננומטר על הגירוי החשמלי של החלק התחתון של צלחת 96 היטב שיש אלקטרודות פחם המשולבות בהם 3. כמו כן, על ידי שימוש בציפוי נקודה, יכולים להיות מצופים נוגדנים ללכוד מרובים לתוך אחד טוב (עד 10 על 96 גם צלחת), המאפשרים כימות בו זמני של חלבונים שונים במדגם יחיד 4. טכניקה זו לאחרונה נעשתה שימוש כדי למדוד את פרופילי ציטוקינים מעודדי דלקת בסרום 5,6. הצלחות זמנית מMSD להשוות בחיוב פלטפורמות זמנית assay אחרים 7. שימוש MSD כפלטפורמה העיקרית assay, אנחנו עוד פיתחה מנהג עשה צלחת 3-Plex שגבו זמנית לכמת את הרמה של לב שרירן מחייב חלבון-C (cMyBP-C), MB קריאטין קינאז-(CK-MB), ולב טרופונין I (cTnI), והתוצאות הושוו עם זיהוי monoplex של cMyBP-C. CK-MB וcTnI הם סמנים ביולוגיים מבוססים היטב לאמ&quot;ן. עם זאת, יכולים להיגרם עליות של סמנים ביולוגיים אלה על ידי פתולוגיות אחרות מאשר אוטם לבבי, כגון דלקת שריר הלב או אי ספיקת כליות 8. זה טוען לתוספת של סמנים ביולוגיים נוספים כדי להגדיל את הספציפיות של אבחון אמ&quot;ן. הראנו לאחרונה כי cMyBP-C היא גם סמנים ביולוגיים פוטנציאליים לMI 9. cMyBP-C הוא חלבון קשור חוט עבה שבא לידי ביטוי בלב, 10-12 אך לא בשלד או חלקה שרירים. לפיכך, הרמה המוגברת של cMyBP-C במערכת הדם היא אינדיקטור מסוים לנזק בלב 13. במחקר זה, השווינו איתור uniplex של cMyBP-C עם שימוש assay 3-Plex מותאם אישית כדי למדוד את רמות סרום שלcMyBP-C, CK-MB, וcTnI בסרום של חולים עם אוטם לבבי. בעתיד, טכניקת חתימה זו עשויה לשמש כדי לאבחן MI בחולים עם הצגת כאבים בחזה בחדר המיון. מוסד ביקורת הלוח (IRB) של האוניברסיטה לויולה שיקגו אישרה את המחקר לשימוש בדגימות אדם deidentified ושימוש בimmunoassay (LU # 20392).

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>R92TC-2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Acros</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Blocker A</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>R93BA-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10X</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP399-4</td>
			<td>Filter before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-137180L</td>
			<td>For coating, antibody has to be gelatin free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plates and Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Array 96-well standard plate</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>L15XA-3</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>N452A-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermaSeal Sealing Film</td>
			<td>Life Science Products Inc.</td>
			<td>ST-3098</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD SECTOR Imager 2400A</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS 2/4 digital microtiter shaker</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3208001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a sensitive and specific quantitation method for determination of serum cardiac myosin binding protein-c by electrochemiluminescence immunoassay

סמנים ביולוגיים הופכים להיות יותר ויותר חשובים בקבלת החלטות קלינית, כמו גם מדע בסיסי. אבחון אוטם שריר הלב (MI) הוא מונע במידה רבה על ידי גילוי לב חלבונים ספציפיים בסרום או הפלזמה של חולים כמדד לפגיעה בשריר לב. לאחר שהראה לאחרונה כי לב שרירן מחייב חלבון-C (cMyBP-C) ניתן לזהות בסרום לאחר אוטם לבבי, יש לנו הצענו אותו כסמן ביולוגי פוטנציאל לאמ&quot;ן. סמנים ביולוגיים מזוהים בדרך כלל על ידי מבחני immunosorbent אנזים צמודי כריך מסורתי. עם זאת, טכניקה זו דורשת נפח דגימה גדול, יש לו טווח דינמי קטן, ויכולה למדוד רק חלבון בכל פעם. כאן אנו מראים immunoassay זמנית שבניתנים למדידה בשלושה חלבוני לב בו זמנית עם רגישות גבוהה. מדידת cMyBP-C יחד בuniplex או עם MB קריאטין קינאז וטרופונין לבי הראה רגישות דומה. טכניקה זו משתמשת בקנה מידת Meso דיסקברי(MSD) שיטת ריבוב בצלחת 96 היטב בשילוב עם electrochemiluminescence לצורך זיהוי. אמנם רק בנפחי מדגם קטנים נדרשים, רגישות גבוהה וטווח דינמי גדול מושגות. שימוש בטכניקה זו, מדדנו I רמות בדגימות סרום מ -16 נבדקים עם MI cMyBP-C, מגה קריאטין קינאז, ולב טרופונין והשווה את התוצאות עם 16 נבדקי ביקורת. היינו מסוגל לזהות את כל שלושת הסמנים בדגימות הללו ומצאנו את כל שלושת סמנים להיות מוגבר לאחר אוטם לבבי. טכניקה זו היא, אם כן, מתאימה לגילוי של סמנים ביולוגיים רגיש לב בדגימות סרום.

את עקרונות היסוד ואת זרימת העבודה של assay 3-Plex מוצגים באיור 1, ואת זרימת העבודה הכוללת מתוארת בטבלה 1. מבחני Uniplex לעבוד יחד באותו עיקרון אלא שכל התחתית היטב מצופה בנוגדן ללכוד אחד. זיהוי אות נעשה על ידי ECL שבו אות חשמלי מוחל על תחתית הבאר. זה, בתורו, יוזם י?...

Watch this Scientific Journal Video about A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay at JoVE.com

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

סמנים ביולוגיים למדידה בדגימות ביולוגיות מורכבות יותר ויותר מנחים את קבלת החלטות קליניות. אנו מתארים שיטה רגישה ביותר למדידה בו זמנית לב שרירן מחייב חלבון-C, מגה קריאטין קינאז, וטרופונין לבי בדגימות סרום מנבדקים עם אוטם שריר הלב ונבדקים בריאים.

שיטת Quantitation רגישה וספציפית לקביעת חלבון-C שרירן לב סרום הכבילה ידי Immunoassay Electrochemiluminescence

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

Research

JoVE Journal

Biology

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

PAR-Clip - שיטה לזהות Transcriptome רחב אתרי קישור של חלבונים RNA הכבילה

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

שיטה לבידוד עכבר הלבלב איילט וקביעת תאית cAMP

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

מיקרוסקופית Intravital של זרימת הדם בשריר העכבר Cremaster לניתוח של נדידת תאי גזע היקפי

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

שיטה ללא טיהור חלבונים של קביעת זיקה מחייבת ידי thermophoresis Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

Microplate Assay מהיר והספציפי לקביעת Ascorbate Intra-ותאי בתאים בתרבית

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

אסטרטגיה בקנה מידה גדולה Metabolomics רגיש, כמותי

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

qPCR הוא שיטה רגישה ומהירה לאיתור של Cytomegaloviral DNA בקבועה פורמלין, רקמות ביופסיה מוטבעות פרפין

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

קשירת יעילה ביותר של RNA קטן מולקולות לMicroRNA Quantitation על ידי רצף תפוקה גבוהה

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

כימות של דביקות תא האנדותל<em&gt; במבחנה</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...