Name: a sensitive and specific quantitation method for determination of serum cardiac myosin binding protein-c by electrochemiluminescence immunoassay
Uploaded: 2013-08-08T11:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay at JoVE.com

Это исследование финансировалось Национальным институтом здоровья и гранты R01HL105826 K02HL114749 (Dr. Sadayappan) и Американской Ассоциации Сердца Запада стипендий; 11PRE7240022 (г-н Barefield) и 13POST14720024 (Dr. Говиндана). Авторы выражают признательность за помощь доктор Джимми Пейдж, Джилл Clampit и д-р Джон Хадсон, MSD, за их отличную техническую поддержку и литературы в развитии анализа.

1. Uniplex cMyBP-C анализа <ol><li> За день до эксперимента, пальто 96-луночных стандартных MSD голой пластины с захватом антител. Для cMyBP-C, используя 30 мкл мышиных моноклональных анти-cMyBP-C антитела (желатина) в концентрации 5 мкг / мл разведенного в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS). ...

<ol>
	<li>Thygesen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Third+universal+definition+of+myocardial+infarction.">Third universal definition of myocardial infarction.</a> Eur. Heart J. 33, 2551-2567 (2012).</li><li>Leng, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELISA+and+multiplex+technologies+for+cytokine+measurement+in+inflammation+and+aging+research.">ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research.</a> J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 63, 879-884 (2008).</li><li>Thompson, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+electrochemiluminescence+wash+and+no-wash+immunoassays+for+detection+of+serum+antibodies+to+smooth+Brucella+strains.">Competitive electrochemiluminescence wash and no-wash immunoassays for detection of serum antibodies to smooth Brucella strains.</a> Clin. Vaccine Immunol. 16, 765-771 (2009).</li><li>Kingsmore, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+measurement:+technologies+and+applications+of+protein+and+antibody+arrays.">Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 5, 310-320 (2006).</li><li>Altan, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long-acting+tumor+necrosis+factor+alpha-binding+protein+demonstrates+activity+in+both+in+vitro+and+in+vivo+models+of+endometriosis.">A long-acting tumor necrosis factor alpha-binding protein demonstrates activity in both in vitro and in vivo models of endometriosis.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 334, 460-466 (2010).</li><li>Patel, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+cytokine+detection+in+acute+coronary+syndrome+reveals+up-regulation+of+interferon+gamma+and+interleukin-10+post+myocardial+infarction.">High sensitivity cytokine detection in acute coronary syndrome reveals up-regulation of interferon gamma and interleukin-10 post myocardial infarction.</a> Clin. Immunol. 133, 251-256 (2009).</li><li>Fu, Q., Zhu, J., Van Eyk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+multiplex+immunoassay+platforms.">Comparison of multiplex immunoassay platforms.</a> Clin. Chem. 56, 314-318 (2010).</li><li>Mahajan, V. S., Jarolim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+interpret+elevated+cardiac+troponin+levels.">How to interpret elevated cardiac troponin levels.</a> Circulation. 124, 2350-2354 (2011).</li><li>Govindan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myosin+binding+protein-C+is+a+potential+diagnostic+biomarker+for+myocardial+infarction.">Cardiac myosin binding protein-C is a potential diagnostic biomarker for myocardial infarction.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 52, 154-164 (2012).</li><li>Barefield, D., Sadayappan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+and+function+of+cardiac+myosin+binding+protein-C+in+health+and+disease.">Phosphorylation and function of cardiac myosin binding protein-C in health and disease.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 48, 866-875 (2010).</li><li>Kuster, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myosin+binding+protein+C+phosphorylation+in+cardiac+disease.">Cardiac myosin binding protein C phosphorylation in cardiac disease.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 43-52 (2012).</li><li>Sadayappan, S., de Tombe, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myosin+binding+protein-C:+redefining+its+structure+and+function.">Cardiac myosin binding protein-C: redefining its structure and function.</a> Biophys. Rev. 4, 93-106 (2012).</li><li>Sadayappan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myosin+binding+protein-C:+a+potential+early-stage,+cardiac-specific+biomarker+of+ischemia-reperfusion+injury.">Cardiac myosin binding protein-C: a potential early-stage, cardiac-specific biomarker of ischemia-reperfusion injury.</a> Biomark Med. 6, 69-72 (2012).</li><li>Fichorova, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+technical+variables+affecting+immunoassay+recovery+of+cytokines+from+human+serum+and+simulated+vaginal+fluid:+a+multicenter+study.">Biological and technical variables affecting immunoassay recovery of cytokines from human serum and simulated vaginal fluid: a multicenter study.</a> Anal. Chem. 80, 4741-4751 (2008).</li><li>Malekzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+multi-plex+and+mono-plex+platforms+for+the+discovery+of+inflammatory+profiles+in+neurodegenerative+diseases.">Challenges in multi-plex and mono-plex platforms for the discovery of inflammatory profiles in neurodegenerative diseases.</a> Methods. 56, 508-513 (2012).</li></ol>

В этом исследовании мы покажем применимость мультиплекса иммуноанализа для обнаружения нескольких сердечных биомаркеров в сыворотке крови у пациентов. Этот метод имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными ELISA. Во-первых, в ECL набора для анализа используют вместо колориметрич?...

Измерение небольших количеств белка в сложных биологических образцов, таких как сыворотка, приобретает все большее клиническое значение для лечения пациента, а также основные науки. Например, увеличение сывороточных уровней сердечных биомаркеров, таких как тропонин I, в клинических условиях согласуется с острым инфарктом миокарда (ИМ) 1. Для обнаружения белков в образцах сыворотки, стандартный твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) является наиболее часто используемым способом, как это имеет высокую чувствительность и позволяет абсолютного количественного определения анализируемого вещества. Однако традиционные ELISA, требуют относительно большого количества образца (как правило, 100 мкл), имеют высокую фонового сигнала в некоторых биологических жидкостей, а ограничиваются измерением только одного аналита в ELISA-2. В последнее время новый метод иммуноанализа была введена в обход многие из этих недостатков. Этот модифицированный анализа, разработанного MSD, использует electrochemiluminescENCE (ECL) для обнаружения сигнала, которая позволяет очень низкий фон и повышенная чувствительность, что позволяет использовать небольшие объемы образца. Электрохемилюминесценция основан на молекуле-репортеру рутений (II) trisbipyridal, которая крепится на обнаружение антител. Это репортерной молекулой излучает свет при 620 нм на электрической стимуляцией в нижней части 96-луночный планшет который имеет углеродные электроды интегрированы в них 3. Кроме того, при использовании точечного покрытия, несколько антител захвата могут быть покрыты в одну лунку (до 10 на 96-луночном планшете), что обеспечивает одновременное определение количества различных белков в одном образце 4. Этот метод был недавно использован для измерения профилей провоспалительных цитокинов в сыворотке 5,6. Мультиплекс плиты из MSD выгодно отличаются от других платформ множественного аналитического 7. Использование MSD в качестве основной платформы анализа, мы также разработали на заказ 3-комплекса, что с пластинойодновременного количественного определения уровня сердечного миозин-связывающего белка-C (cMyBP-C), креатин-киназы MB (CK-MB), и сердечный тропонин I (cTnI), и результаты сравнивали с monoplex обнаружения cMyBP-C. CK-MB и cTnI хорошо отлаженных биомаркеров для ИМ. Однако увеличение этих маркеров может быть вызвано патологий, кроме М.И., например, миокардит или почечной недостаточностью 8. Это свидетельствует о добавлении дополнительных биомаркеров для увеличения специфичности диагностики инфаркта миокарда. Недавно мы показали, что cMyBP-C также является потенциальным биомаркеров для MI 9. cMyBP-C представляет собой толстую нить ассоциированный белок, который экспрессируется в сердце, 10-12, но не в скелетной или гладкой мускулатуры. Таким образом, повышение уровня cMyBP-C в системе кровообращения является специфическим показателем повреждения сердца 13. В этом исследовании сравнивали Uniplex обнаружения cMyBP-C с использованием пользовательского 3-комплекса анализе на определение сывороточных уровнейcMyBP-C, CK-MB, и cTnI в сыворотке крови больных с ОИМ. В будущем эта подпись техники может быть использован для диагностики инфаркта миокарда у пациентов с болями в груди в отделении неотложной помощи. Учреждение обзор платы (IRB) из Университета Лойолы Чикаго одобрил исследования для использования deidentified человека образцы и использование иммуноферментного анализа (LU # 20392).

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>R92TC-2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Acros</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Blocker A</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>R93BA-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10X</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP399-4</td>
			<td>Filter before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-137180L</td>
			<td>For coating, antibody has to be gelatin free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plates and Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Array 96-well standard plate</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>L15XA-3</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>N452A-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermaSeal Sealing Film</td>
			<td>Life Science Products Inc.</td>
			<td>ST-3098</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD SECTOR Imager 2400A</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS 2/4 digital microtiter shaker</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3208001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a sensitive and specific quantitation method for determination of serum cardiac myosin binding protein-c by electrochemiluminescence immunoassay

Биомаркеров становится все более важным в принятии клинических решений, а также фундаментальной науки. Диагностика инфаркта миокарда (ИМ) во многом основывается на выявлении сердечно-специфических белков в пациентов сыворотки или плазмы в качестве индикатора повреждения миокарда. Недавно показано, что сердечный миозин-связывающего белка-С (cMyBP-C) можно обнаружить в сыворотке крови после ИМ, мы предложили его в качестве потенциальных биомаркеров ИМ. Биологические маркеры обычно обнаруживаются традиционными сэндвич иммуноферментного анализа. Однако этот метод требует большого объема пробы, имеет небольшой динамический диапазон, и может измерять только один белок одновременно. Здесь мы показываем, мультиплексе иммунотестом, в котором три сердечных белки могут быть измерены одновременно с высокой чувствительностью. Измерение cMyBP-C в Uniplex или вместе с креатина киназы MB и сердечного тропонина я показал чувствительность сопоставима. Эта техника использует мезо Масштаб Discovery(MSD) способ мультиплексирования в 96-луночный планшет в сочетании с электрохемилюминесценция для обнаружения. В то время как лишь небольшие объемы образцов требуются высокая чувствительность и широкий динамический диапазон будут достигнуты. Используя эту технику, мы измерили cMyBP-C, креатин киназы MB и сердечного тропонина I в сыворотке крови образцы из 16 пациентов с ИМ и сравнили результаты с 16 субъектами управления. Мы смогли обнаружить все три маркера в этих образцах и нашел всех трех биомаркеров быть увеличена после ИМ. Этот способ, следовательно, подходит для чувствительного обнаружения сердечных биомаркеров в образцах сыворотки.

Основные принципы и процесс 3-комплекса анализа показаны на рисунке 1, а общий процесс описан в таблице 1. Uniplex анализов работать по тому же принципу, за исключением того, что все дно скважины покрыты одним иммобилизованным антителом. Обнаружение сигнала осуществляется...

Watch this Scientific Journal Video about A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay at JoVE.com

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Измерения биомаркеров в сложных биологических образцов все больше руководящих принятия клинических решений. Мы описываем высокочувствительным методом для одновременного измерения сердечного миозин-связывающего белка С, креатин киназы MB и сердечного тропонина I в образцах сыворотки пациентов с инфарктом миокарда и группой контроля.

Чувствительностью и специфичностью Количественный метод определения Сыворотка Сердечная Миозина связывающий белок-C по электрохемилюминесценцию иммуноферментного

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

Research

JoVE Journal

Biology

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

PAR-Clip - метод идентификации транскриптома всей места связывания РНК-связывающие белки

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Метод мышь панкреатических островков изоляции и внутриклеточного цАМФ определения

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

Прижизненные микроскопия микроциркуляцию в мышцах мыши Кремастер для анализа периферических стволовых клеток миграции

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Очистки белков-Free метод привязки Определение Affinity по Микромасштабные Термофорез

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

Быстрое и Удельный Микропланшетный Анализ для определения внутри-и внеклеточной аскорбат в культивируемых клетках

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Стратегия для чувствительной, крупномасштабного Количественные Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

КПЦР является чувствительным и быстрый метод для обнаружения цитомегаловирусной ДНК в формалине фиксированной парафин биопсии ткани

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

Высокоэффективная Лигирование малых РНК молекул для микроРНК количественного путем высокопроизводительного секвенирования

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Количественное эндотелиальных клеток адгезивностью<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...