Name: a sensitive and specific quantitation method for determination of serum cardiac myosin binding protein-c by electrochemiluminescence immunoassay
Uploaded: 2013-08-08T11:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay at JoVE.com

Bu çalışma, Sağlık hibe Ulusal Sağlık Enstitüleri R01HL105826 ve K02HL114749 (Dr Sadayappan) ve Amerikan Kalp Derneği Midwest Arkadaş grupları tarafından finanse edildi; 11PRE7240022 (Bay Barefield) ve 13POST14720024 (Dr Govindan). Yazarlar minnetle tahlil gelişmekte olan kendi mükemmel teknik ve edebiyat destek için Dr Jimmy Page, Jill Clampit ve Dr John Hudson, MSD, yardımı kabul.

1. UNIPLEX cMyBP-C Testi <ol><li> Yakalama antikor ile deney, kat 96-MSD çıplak standart plaka önceki gün. CMyBP-C, 5 mg / fosfat içinde seyreltilmiş ml &#39;lik bir konsantrasyonda, fare monoklonal anti-cMyBP-C antikoru (jelatin serbest) bir 30 ul hacim kullanımı salin (PBS) tamponlu. </li><li> Iyi hidrofobik olduğu için, kuyunun dibinde köşeye çözüm pipetle, daha sonra tüm aşkın çözüm yaymak için plaka yanlarına dokunun. </li><li> Plaka plaka örtücü ile kaplı ve sallayarak olmadan 4 ° C&#...

<ol>
	<li>Thygesen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Third+universal+definition+of+myocardial+infarction.">Third universal definition of myocardial infarction.</a> Eur. Heart J. 33, 2551-2567 (2012).</li><li>Leng, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELISA+and+multiplex+technologies+for+cytokine+measurement+in+inflammation+and+aging+research.">ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research.</a> J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 63, 879-884 (2008).</li><li>Thompson, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+electrochemiluminescence+wash+and+no-wash+immunoassays+for+detection+of+serum+antibodies+to+smooth+Brucella+strains.">Competitive electrochemiluminescence wash and no-wash immunoassays for detection of serum antibodies to smooth Brucella strains.</a> Clin. Vaccine Immunol. 16, 765-771 (2009).</li><li>Kingsmore, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+measurement:+technologies+and+applications+of+protein+and+antibody+arrays.">Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 5, 310-320 (2006).</li><li>Altan, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long-acting+tumor+necrosis+factor+alpha-binding+protein+demonstrates+activity+in+both+in+vitro+and+in+vivo+models+of+endometriosis.">A long-acting tumor necrosis factor alpha-binding protein demonstrates activity in both in vitro and in vivo models of endometriosis.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 334, 460-466 (2010).</li><li>Patel, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+cytokine+detection+in+acute+coronary+syndrome+reveals+up-regulation+of+interferon+gamma+and+interleukin-10+post+myocardial+infarction.">High sensitivity cytokine detection in acute coronary syndrome reveals up-regulation of interferon gamma and interleukin-10 post myocardial infarction.</a> Clin. Immunol. 133, 251-256 (2009).</li><li>Fu, Q., Zhu, J., Van Eyk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+multiplex+immunoassay+platforms.">Comparison of multiplex immunoassay platforms.</a> Clin. Chem. 56, 314-318 (2010).</li><li>Mahajan, V. S., Jarolim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+interpret+elevated+cardiac+troponin+levels.">How to interpret elevated cardiac troponin levels.</a> Circulation. 124, 2350-2354 (2011).</li><li>Govindan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myosin+binding+protein-C+is+a+potential+diagnostic+biomarker+for+myocardial+infarction.">Cardiac myosin binding protein-C is a potential diagnostic biomarker for myocardial infarction.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 52, 154-164 (2012).</li><li>Barefield, D., Sadayappan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+and+function+of+cardiac+myosin+binding+protein-C+in+health+and+disease.">Phosphorylation and function of cardiac myosin binding protein-C in health and disease.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 48, 866-875 (2010).</li><li>Kuster, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myosin+binding+protein+C+phosphorylation+in+cardiac+disease.">Cardiac myosin binding protein C phosphorylation in cardiac disease.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 43-52 (2012).</li><li>Sadayappan, S., de Tombe, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myosin+binding+protein-C:+redefining+its+structure+and+function.">Cardiac myosin binding protein-C: redefining its structure and function.</a> Biophys. Rev. 4, 93-106 (2012).</li><li>Sadayappan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myosin+binding+protein-C:+a+potential+early-stage,+cardiac-specific+biomarker+of+ischemia-reperfusion+injury.">Cardiac myosin binding protein-C: a potential early-stage, cardiac-specific biomarker of ischemia-reperfusion injury.</a> Biomark Med. 6, 69-72 (2012).</li><li>Fichorova, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+technical+variables+affecting+immunoassay+recovery+of+cytokines+from+human+serum+and+simulated+vaginal+fluid:+a+multicenter+study.">Biological and technical variables affecting immunoassay recovery of cytokines from human serum and simulated vaginal fluid: a multicenter study.</a> Anal. Chem. 80, 4741-4751 (2008).</li><li>Malekzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+multi-plex+and+mono-plex+platforms+for+the+discovery+of+inflammatory+profiles+in+neurodegenerative+diseases.">Challenges in multi-plex and mono-plex platforms for the discovery of inflammatory profiles in neurodegenerative diseases.</a> Methods. 56, 508-513 (2012).</li></ol>

Bu çalışmada, hastalarda serum birden fazla kardiyak biyolojik tespiti için bir multipleks immunoassay uygulanabilirliğini göstermektedir. Bu teknik, geleneksel ELISA üzerinde birçok avantajı vardır. İlk olarak, test kiti ECL kolorimetrik tespit yerine kullanılır. ECL olarak, bir elektrik sinyali 14 azaltır, böylece arka plan sinyali, ikinci uyarım durumunda ayrılmasının, ölçülen özelliği (ışık) yerel üretimini uyarır. Bu durum, Tablo 2&#39;de de görülebileceği...

Örneğin, serum gibi karmaşık biyolojik örnekler, protein düşük miktarda ölçümü hasta yönetimi, hem de temel bilim için artan bir klinik önem taşımaktadır. Örneğin, bir klinik ortamda bu troponin I gibi kardiyak biyolojik serum, artış akut miyokard infarktüsü (Mİ) 1 ile tutarlıdır. Bu yüksek hassasiyete sahiptir ve analit ölçümü için mutlak izin verdiği serum örneklerinde proteinleri saptamak için, standart bir enzim-linked immunosorbent assay (ELISA), en sık kullanılan bir tekniktir. Ancak, geleneksel ELISA, örneğin nispeten büyük miktarda (tipik olarak 100 ul) gerektiren bazı biyolojik akışkanlar içinde yüksek bir arka plan sinyali, ve ELISA 2 başına sadece bir analit ölçümü ile sınırlıdır. Son zamanlarda, yeni bir immunoassay tekniği bu sakıncaları birçok circumvents geçilmiştir. Bu modifiye tahlil, MSD tarafından geliştirilen, electrochemiluminesc kullanırKüçük bir numune hacimlerinin kullanımını mümkün kılmak için çok düşük arka plan ve artan bir hassasiyet sağlayan sinyal tespiti için etkisiyle (ECL). Elektro algılama antikorlara bağlı raportör molekülün rutenyum (II) &#39;trisbipyridal esas alınmaktadır. Bu, raportör molekülün bunları 3 entegre karbon elektrot olan 96-kuyulu plakanın alt elektriksel stimülasyonu üzerine 620 nm&#39;de ışık yayar. Ayrıca, spot kaplama kullanılarak, birden çok yakalama antikorları, tek bir örnek 4, farklı proteinlerinin aynı anda ölçümü sağlayan, iyi bir (en fazla 10, 96 oyuklu plaka) halinde kaplanabilir. Bu teknik en son serum 5,6 proinflamatuar sitokin profilleri ölçmek için kullanılmıştır. MSD gelen çok katlı levhalar olumlu diğer çok katlı testi platformlara 7 karşılaştırmak. Birincil test platformu olarak MSD kullanarak, daha fazla 3-karmaşık plaka yapılmış bir özel geliştirilen cbir anda kalp miyozin bağlayıcı protein-C (cMyBP-C), kreatin-kinaz MB (CK-MB) ve kardiyak troponin I (cTnI) seviyesini ölçmek ve sonuçları cMyBP-C Monoplex tespiti ile karşılaştırıldı. CK-MB ve cTnI MI için köklü biyolojik bulunmaktadır. Ancak bu biyolojik artışlar örneğin miyokardit veya böbrek yetmezliği 8, MI dışındaki patolojiler neden olabilir. Bu MI tanı özgünlüğünü artırmak için ek biyolojik eklenmesi için savunuyor. Son zamanlarda cMyBP-C de mi 9 için potansiyel bir biyolojik olduğunu göstermiştir. cMyBP-C kalp, iskelet veya değil, düz kaslarda, 10-12 olarak ifade edilir, kalın filaman ilişkili bir proteindir. Bu nedenle, kan dolaşım sistemi içinde cMyBP-C artan seviyesi kalp hasarı 13 belirli bir göstergesidir. Bu çalışmada, serum seviyelerinin ölçülmesi için özel bir 3-Plex tahlilin kullanımı ile cMyBP-C UNIPLEX tespiti görecMyBP-C, CK-MB ve MI hastaların serum cTnI. Gelecekte, bu imza teknik acil serviste göğüs ağrısı ile başvuran hastalarda MI teşhis etmek için kullanılabilir. Loyola University Chicago kurumu inceleme kurulu (KİK) deidentified insan örneklerinin kullanımı ve immunoassay ve kullanımı (LU # 20392) için çalışmayı onayladı.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>R92TC-2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Acros</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Blocker A</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>R93BA-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10X</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP399-4</td>
			<td>Filter before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-137180L</td>
			<td>For coating, antibody has to be gelatin free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plates and Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Array 96-well standard plate</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>L15XA-3</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>N452A-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermaSeal Sealing Film</td>
			<td>Life Science Products Inc.</td>
			<td>ST-3098</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD SECTOR Imager 2400A</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS 2/4 digital microtiter shaker</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3208001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a sensitive and specific quantitation method for determination of serum cardiac myosin binding protein-c by electrochemiluminescence immunoassay

Biyolojik hem de temel bilim, karar verme klinik giderek daha önemli hale gelmektedir. Teşhis miyokard infarktüsü (Mİ) büyük ölçüde miyokard hasarının bir göstergesi olarak hastaların serum veya plazma kardiyak-spesifik proteinlerin tespit ile tahrik edilir. Son zamanlarda kardiyak miyosin bağlayıcı protein-C (cMyBP-C), MI sonrası serum içinde tespit olduğunu göstermiştir, biz MI için potansiyel bir biyolojik olarak önerilmiştir. Biyolojik genellikle geleneksel sandviç enzim-bağlı immünosorbent testleri ile tespit edilir. Ancak, bu teknik, büyük bir örnek hacmi gerektiren küçük bir dinamik aralık vardır ve bir seferde sadece bir protein ölçebilirsiniz. Burada üç kalp proteinler yüksek hassasiyet ile eş zamanlı olarak ölçülebilir hangi çok katlı bir bağışıklık göstermektedir. Kreatin kinaz MB ve kardiyak troponin ile UNIPLEX veya birlikte cMyBP-C Ölçüm ben karşılaştırılabilir duyarlılık gösterdi. Bu teknik Mezo Ölçeği Discovery kullanırTespiti için elektro ile birlikte bir 96 oyuklu plaka çoğullama (MSD) yöntemi. Sadece küçük bir örnek hacimleri gerekli iken, yüksek hassasiyet ve geniş dinamik aralık elde edilir. Bu tekniği kullanarak, cMyBP-C, kreatin kinaz MB ve kardiyak troponin MI ile 16 denekten serum örneklerinde Ben düzeyleri ölçüldü ve 16 kontrol grubu ile sonuçlar karşılaştırıldı. Biz bu örnekleri her üç işaretleri tespit başardık ve MI sonrası artmış olduğu üç biyolojik bulundu. Bu teknik, bu nedenle, serum numuneleri kalp biyolojik arasında hassas bir şekilde tespit uygundur.

3-Plex tahlilinin temel ilkeler ve akışı Şekil 1 &#39;de gösterilmektedir ve genel akışı Tablo 1&#39; de tarif edilmektedir. UNIPLEX deneyleri tüm alt iyi bir yakalama antikor ile kaplı olması dışında aynı prensip boyunca çalışır. Sinyal algılama bir elektrik sinyali kuyunun dibine uygulandığı ECL yapılır. Bu da, algılama antikoru üzerindeki sülfo-etiketi ile salt tampon, bir kimyasal reaksiyon yoluyla bir ışık yerel üretimini başlatır....

Watch this Scientific Journal Video about A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay at JoVE.com

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Karmaşık biyolojik örneklerde ölçüm biyolojik giderek karar verme klinik rehberlik. Biz aynı anda kalp miyozin bağlayıcı protein-C, kreatin kinaz MB ve miyokard infarktüsü ve sağlıklı kontrol grubu olan hastalarda serum örneklerinde kardiyak troponin I ölçmek için son derece hassas bir yöntem açıklanmaktadır.

Elektrokemiluminesan immunoassay Serum Kardiyak Miyozin Bağlayıcı Protein-C belirlenmesi için hassas ve özel miktar tayini yöntemi

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

Research

JoVE Journal

Biology

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

PAR-Klip - RNA Cilt Proteinler Transcriptome geniş Cilt Siteleri Belirlemek Amacıyla Bir Yöntem

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Fare Pankreas Adacık İzolasyonu ve hücre içi cAMP Belirlenmesi için Bir Yöntem

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

Periferik Kök Hücre Göç Analizi Fare Cremaster Muscle Mikrosirkülasyon Intravital Mikroskopi

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Mikro Termoforosis tarafından Bağlama Affinity belirlenmesi Protein Saflaştırma-ücretsiz Yöntemi

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

Kültür Hücrelerinin Intra-ve Ekstrasellüler Askorbat Belirlenmesi için hızlı ve spesifik bir Mikroplate Deneyi

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Hassas, Büyük Ölçekli Kantitatif metabolomik için bir strateji

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

QPCR Formalinle sabit, Parafin-gömülü Biyopsi Doku sitomegaloviral DNA tespiti için bir Hassas ve Hızlı Yöntem mi

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

Yüksek Verim Dizilimine tarafından MicroRNA ölçümü için Küçük RNA molekülleri, yüksek Verimli ligasyonu

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Endotel Hücre yapışma miktarının belirlenmesi<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...