Name: studying interactions of staphylococcus aureus with neutrophils by flow cytometry and time lapse microscopy
Uploaded: 2013-07-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy at JoVE.com

<p class="jove_content"&gt; RN blev delvist finansieret af et Marie Curie europæisk-hjemvendelseslegater (ERG) fra Det Europæiske Fællesskabs syvende rammeprogram, projekt nr. 268.324.</p&gt;

1.. Isolering af PMNs af menneskeblod ved massefyldecentrifugering <ol><li> Tegn 5 9 ml rør af hepariniseret veneblod. </li><li> Forbered dual layer Ficoll gradienter (4 gradienter for 5 rør blod) som følger: Hæld 12 ml af en massefylde 1,119 g / ml Ficoll opløsning i et 50 ml rør og omhyggeligt lag 10 ml af en massefylde 1,077 g / ml Ficoll opløsning på toppen. </li><li> Fortyndes blodet med et tilsvarende volumen PBS. </li><li> Lag det fortyndede blod forsigtigt på dual layer Ficoll gradient, 20-25 ml pr gr...

<ol>
	<li>Rigby, K. M., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+innate+host+defense+against+Staphylococcus+aureus+infections.">Neutrophils in innate host defense against Staphylococcus aureus infections.</a> Semin. Immunopathol. 34, 237-259 (2012).</li><li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+Mechanisms+Used+by+Staphylococcus+aureus+to+Avoid+Destruction+by+Human+Neutrophils.">Insights into Mechanisms Used by Staphylococcus aureus to Avoid Destruction by Human Neutrophils.</a> The Journal of Immunology. 175, 3907-3919 (2005).</li><li>Kobayashi, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+neutrophil+destruction+following+phagocytosis+of+Staphylococcus+aureus.">Rapid neutrophil destruction following phagocytosis of Staphylococcus aureus.</a> J. Innate Immun. 2, 560-575 (2010).</li><li>DeLeo, F. R., Otto, M., Kreiswirth, B. N., Chambers, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community-associated+meticillin-resistant+Staphylococcus+aureus.">Community-associated meticillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> The Lancet. 375, 1557 (2010).</li><li>David, M. Z., Daum, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community-Associated+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus:+Epidemiology+and+Clinical+Consequences+of+an+Emerging+Epidemic.">Community-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: Epidemiology and Clinical Consequences of an Emerging Epidemic.</a> Clinical Microbiology Reviews. 23, 616-687 (2010).</li><li>Kretschmer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Formyl+Peptide+Receptor+2+Senses+Highly+Pathogenic+Staphylococcus+aureus.">Human Formyl Peptide Receptor 2 Senses Highly Pathogenic Staphylococcus aureus.</a> Cell Host &amp; Microbe. 7, 463 (2010).</li><li>Prat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+homolog+of+formyl+peptide+receptor-like+1+(FPRL1)+inhibitor+from+Staphylococcus+aureus+(FPRL1+inhibitory+protein)+that+inhibits+FPRL1+and+FPR.">A homolog of formyl peptide receptor-like 1 (FPRL1) inhibitor from Staphylococcus aureus (FPRL1 inhibitory protein) that inhibits FPRL1 and FPR.</a> J. Immunol. 183, 6569-6578 (2009).</li><li>Prat, C., Bestebroer, J., de Haas, C. J. C., van Strijp, J. A. G., van Kessel, K. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Staphylococcal+Anti-Inflammatory+Protein+That+Antagonizes+the+Formyl+Peptide+Receptor-Like+1.">A New Staphylococcal Anti-Inflammatory Protein That Antagonizes the Formyl Peptide Receptor-Like 1.</a> The Journal of Immunology. 177, 8017-8026 (2006).</li><li>de Haas, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+inhibitory+protein+of+Staphylococcus+aureus,+a+bacterial+antiinflammatory+agent.">Chemotaxis inhibitory protein of Staphylococcus aureus, a bacterial antiinflammatory agent.</a> The Journal of Experimental Medicine. 199, 687-695 (2004).</li><li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+Staphylococcal+Phenol+Soluble+Modulins+by+Serum+Lipoprotein+Particles.">Inactivation of Staphylococcal Phenol Soluble Modulins by Serum Lipoprotein Particles.</a> PLoS Pathog. 8, e1002606 (2012).</li><li>Kubica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Potential+New+Pathway+for+Staphylococcus+aureus+Dissemination:+The+Silent+Survival+of+S.+aureus+Phagocytosed+by+Human+Monocyte-Derived+Macrophages.">A Potential New Pathway for Staphylococcus aureus Dissemination: The Silent Survival of S. aureus Phagocytosed by Human Monocyte-Derived Macrophages.</a> PLoS ONE. 3, e1409 (2008).</li><li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+alpha-phenol+soluble+modulins+contribute+to+neutrophil+lysis+after+phagocytosis.">Staphylococcal alpha-phenol soluble modulins contribute to neutrophil lysis after phagocytosis.</a> Cellular Microbiology. , (2013).</li><li>Queck, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAIII-Independent+Target+Gene+Control+by+the+agr+Quorum-Sensing+System:+Insight+into+the+Evolution+of+Virulence+Regulation+in+Staphylococcus+aureus.">RNAIII-Independent Target Gene Control by the agr Quorum-Sensing System: Insight into the Evolution of Virulence Regulation in Staphylococcus aureus.</a> Molecular Cell. 32, 150 (2008).</li><li>Baban, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+Bacterial+Imaging+In+Vivo.">Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo.</a> J. Vis. Exp. (69), e4318 (2012).</li></ol>

I de her beskrevne metoder nogle trin er meget kritisk. Vi vil fremhæve disse her. Til isolering af neutrofiler ved densitetsgradientcentrifugering er det vigtigt ikke at forstyrre lagene under eller efter centrifugeringstrin. Når sugning neutrofilerne hjælp af en plastic pipette, så sørg for ikke at presse ballonen, mens i det lag af celler, vil så skubbe væske forstyrre lag. Også visuelt inspicere pelleten af ​​neutrofiler efter osmotisk chok og centrifugeringstrin. Hvis pellet...

Neutrofile (PMN&#39;er) er professionelle fagocytter, der spiller en central rolle i det medfødte immunforsvar mod Staphylococcus aureus 1.. Den konstante kamp mellem vært og mikrobe har ført til et våbenkapløb af begge. Senest EF-associerede (CA) stammer af meticillin resistente S. aureus (MRSA) er dukket op, synes at være meget effektive i omgåelse af neutrofile drab 2,3. Overdreven phenol opløselig modulin (PSM&#39;erne) fremstilling af CA-MRSA er blevet forbundet med højere virulens 4,5. Humane neutrofiler kan genkende disse PSM&#39;er via FPR2 som fører til aktivering af denne G-protein koblet receptor 6.. En af de tidligste begivenheder mobilisering af intracellulære lagre af calcium (Ca 2 +). Ca2 + virker som en sekundær budbringer for en række effektorfunktioner PMN&#39;er herunder degranulering og fagocytose 7.. Derfor Ca 2 + er en meget følsom indikator forfunktionsevne af PSM&#39;er at aktivere PMN&#39;er. At undersøge virkningerne af PSM&#39;er på neutrofiler, er friske neutrofiler isoleres og fyldt med et farvestof, som fluorescerer ved calciummobilisering. I et flowcytometri eksperiment denne hurtig mobilisering kan måles. Ved hjælp af denne metode, er det muligt at studere de direkte virkninger af toksiske og andre komponenter på neutrofiler, og bestemme den laveste koncentration, hvor disse er aktive. For os er det et meget nyttigt redskab til at undersøge effekten af mange proteiner produceret af S. aureus er involveret i immun unddragelse, såsom FPR2 inhiberende protein (FLIPR) 8, FLIPR-lignende 7, og Kemotaksi hæmmende protein af Staphylococcus aureus (spåner) 9.. Alle disse proteiner har vist sig at hæmme calciummobilisering i neutrofiler ved binding til receptoren anerkende agonist. For nylig har vores gruppe beskrevet, at PSM&#39;er funktionelt hæmmes af serumlipoproteiner 10 &lt;/ Sup&gt;. Disse lipoproteiner er rigeligt til stede i blod og humant væv, hvilket indikerer, at PSM&#39;er udøve deres funktion primært i det intracellulære miljø. Tilgængeligheden af ​​calciummobilisering assayet tilladt os at præcist at måle effekten af ​​serumlipoproteiner på aktivering af neutrofiler af PSM&#39;er angivet ved betydelig hæmning af meget lave koncentrationer af serum. Eftersom PSM&#39;er funktionelt inhiberes af serum, vi antager, at der er en vigtig funktion for PSM&#39;er som intracellulære toksiner. Vi har derfor forsøgt at fastlægge den rolle PSM&#39;er efter fagocytose. For at undersøge ekspressionen af PSM&#39;erne i intercellulære rum, vi har opbygget reporter fusioner af initiativtagerne til psmα operon til GFP. Når disse reporter stammer af S. aureus blev fagocyteret af neutrofiler, blev induktionen af udtrykket observerbare hjælp fluorescensmikroskopi 10.. Naturligvis er denne technique tillader undersøgelse af ekspressionen af et stort antal gener i S. aureus eller andre patogener efter fagocytose. Eftersom for S. aureus overleve i intercellulære niche er meget vigtigt at overvinde det medfødte immunsystem 11 10 12, studere rollen af gener aktiveres i denne niche er yderst relevant for forståelsen af virulens.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-3, AM</td>
			<td>Molecular Probes / Life Technologies</td>
			<td>F-1241</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5442-03</td>
			<td>density 1.077 g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11191</td>
			<td>density 1.119 g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>52400-025</td>
			<td>contains 25 mM HEPES and L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, The Netherlands</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td>objective: HCX PL APO 40X/0.85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>Very important that the tube can be removed and replaced during the measurement process</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying interactions of staphylococcus aureus with neutrophils by flow cytometry and time lapse microscopy

Vi præsenterer metoder til at undersøge effekten af phenol opløselige modulins (PSM&#39;er) og andre toksiner produceres og udskilles af Staphylococcus aureus på neutrofiler. At studere virkningerne af PSM&#39;er på neutrofiler vi isolerer friske neutrofiler hjælp densitetsgradientcentrifugering. Disse neutrofiler er fyldt med et farvestof, der fluorescerer ved calciummobilisering. Aktiveringen af ​​neutrofiler ved PSM&#39;er indleder en hurtig og forbigående stigning i den frie intracellulære calciumkoncentration. I en flowcytometri eksperiment denne hurtig mobilisering kan måles ved overvågning af fluorescensen af et præ-loadet farvestof, der reagerer på den forøgede koncentration af frit Ca2 +. Med denne metode kan vi bestemme PSM nødvendige koncentration for at aktivere neutrofile, og måle effekten af ​​specifikke og generelle inhibitorer af neutrofil aktivering. For at undersøge ekspressionen af ​​PSM&#39;erne i intracellulære rum, we har konstrueret reporter fusioner af initiativtagerne til PSMα operon til GFP. Når disse reporter stammer af S. aureus er fagocyteret af neutrofiler, kan induktionen af ekspression observeret ved hjælp af fluorescensmikroskopi.

Flowcytometrisk assay til vurdering af calciummobilisering i humane PMN&#39;er Inkubering neutrofiler med en koncentration række syntetiske PSMα3 resulterer i hurtig aktivering som målt ved calciumflux, hvilket viser sig ved en stigning i signalet i FL-1. Præ-inkubering af syntetisk PSMα3 med 0,01%, 0,1% eller 1% humant serum inhiberede signifikant evnen til at fremkalde calcium flux (Figur 1). Analyse af GFP-ekspression i bakterier efter fagocyto...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy at JoVE.com

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Vi præsenterer metoder til at undersøge effekten af ​​PSM&#39;er og andre toksiner udskilt af<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; På neutrofiler ved hjælp af flowcytometri og fluorescens mikroskopi.

Studere Interaktioner af<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Med Neutrophils ved flowcytometri og Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Vækst med humant hæmoglobin som en jernkilde

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

En enkel og effektiv metode til at påvise Nuclear Factor Aktivering i humane neutrofiler ved flowcytometri

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Påvisning af fluorescerende Nanopartikel Interaktioner med Primary Immune cellesubpopulationer ved flowcytometri

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Imaging neutrofiler og monocytter i Mesenterial Veins af Intravital Mikroskopi på bedøvede mus i Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

genotypebestemmelse af<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; ved Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

Metode for Studiet af horisontal genoverførsel i<em&gt; Staphylococcus aureus</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation og In Vitro kultur af Murine og menneskelige alveolær makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Time-lapse 3D Imaging af fagocytose af musen makrofager

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...