Name: studying interactions of staphylococcus aureus with neutrophils by flow cytometry and time lapse microscopy
Uploaded: 2013-07-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy at JoVE.com

<p class="jove_content"&gt; RN werd gedeeltelijk gefinancierd door een Marie Curie-Europese Re-integratie Grants (ERG) uit zevende kaderprogramma van de Europese Gemeenschap, projectnummer 268324.</p&gt;

1. Isolatie van PMN&#39;s uit menselijk bloed door dichtheidscentrifugeren <ol><li> Teken 5 9 ml tubes van heparine veneuze bloed. </li><li> Bereid dual layer Ficoll gradiënten (4 gradiënten van 5 buisjes bloed) als volgt: Giet 12 ml van een dichtheid van 1,119 g / ml Ficoll-oplossing in een 50 ml buis en voorzichtig laag 10 ml met een dichtheid 1,077 g / ml Ficoll-oplossing geplaatst. </li><li> Verdun het bloed met een gelijk volume PBS. </li><li> Layer het verdunde bloed zorgvuldig op de dual layer Ficoll gradiën...

<ol>
	<li>Rigby, K. M., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+innate+host+defense+against+Staphylococcus+aureus+infections.">Neutrophils in innate host defense against Staphylococcus aureus infections.</a> Semin. Immunopathol. 34, 237-259 (2012).</li><li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+Mechanisms+Used+by+Staphylococcus+aureus+to+Avoid+Destruction+by+Human+Neutrophils.">Insights into Mechanisms Used by Staphylococcus aureus to Avoid Destruction by Human Neutrophils.</a> The Journal of Immunology. 175, 3907-3919 (2005).</li><li>Kobayashi, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+neutrophil+destruction+following+phagocytosis+of+Staphylococcus+aureus.">Rapid neutrophil destruction following phagocytosis of Staphylococcus aureus.</a> J. Innate Immun. 2, 560-575 (2010).</li><li>DeLeo, F. R., Otto, M., Kreiswirth, B. N., Chambers, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community-associated+meticillin-resistant+Staphylococcus+aureus.">Community-associated meticillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> The Lancet. 375, 1557 (2010).</li><li>David, M. Z., Daum, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community-Associated+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus:+Epidemiology+and+Clinical+Consequences+of+an+Emerging+Epidemic.">Community-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: Epidemiology and Clinical Consequences of an Emerging Epidemic.</a> Clinical Microbiology Reviews. 23, 616-687 (2010).</li><li>Kretschmer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Formyl+Peptide+Receptor+2+Senses+Highly+Pathogenic+Staphylococcus+aureus.">Human Formyl Peptide Receptor 2 Senses Highly Pathogenic Staphylococcus aureus.</a> Cell Host &amp; Microbe. 7, 463 (2010).</li><li>Prat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+homolog+of+formyl+peptide+receptor-like+1+(FPRL1)+inhibitor+from+Staphylococcus+aureus+(FPRL1+inhibitory+protein)+that+inhibits+FPRL1+and+FPR.">A homolog of formyl peptide receptor-like 1 (FPRL1) inhibitor from Staphylococcus aureus (FPRL1 inhibitory protein) that inhibits FPRL1 and FPR.</a> J. Immunol. 183, 6569-6578 (2009).</li><li>Prat, C., Bestebroer, J., de Haas, C. J. C., van Strijp, J. A. G., van Kessel, K. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Staphylococcal+Anti-Inflammatory+Protein+That+Antagonizes+the+Formyl+Peptide+Receptor-Like+1.">A New Staphylococcal Anti-Inflammatory Protein That Antagonizes the Formyl Peptide Receptor-Like 1.</a> The Journal of Immunology. 177, 8017-8026 (2006).</li><li>de Haas, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+inhibitory+protein+of+Staphylococcus+aureus,+a+bacterial+antiinflammatory+agent.">Chemotaxis inhibitory protein of Staphylococcus aureus, a bacterial antiinflammatory agent.</a> The Journal of Experimental Medicine. 199, 687-695 (2004).</li><li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+Staphylococcal+Phenol+Soluble+Modulins+by+Serum+Lipoprotein+Particles.">Inactivation of Staphylococcal Phenol Soluble Modulins by Serum Lipoprotein Particles.</a> PLoS Pathog. 8, e1002606 (2012).</li><li>Kubica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Potential+New+Pathway+for+Staphylococcus+aureus+Dissemination:+The+Silent+Survival+of+S.+aureus+Phagocytosed+by+Human+Monocyte-Derived+Macrophages.">A Potential New Pathway for Staphylococcus aureus Dissemination: The Silent Survival of S. aureus Phagocytosed by Human Monocyte-Derived Macrophages.</a> PLoS ONE. 3, e1409 (2008).</li><li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+alpha-phenol+soluble+modulins+contribute+to+neutrophil+lysis+after+phagocytosis.">Staphylococcal alpha-phenol soluble modulins contribute to neutrophil lysis after phagocytosis.</a> Cellular Microbiology. , (2013).</li><li>Queck, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAIII-Independent+Target+Gene+Control+by+the+agr+Quorum-Sensing+System:+Insight+into+the+Evolution+of+Virulence+Regulation+in+Staphylococcus+aureus.">RNAIII-Independent Target Gene Control by the agr Quorum-Sensing System: Insight into the Evolution of Virulence Regulation in Staphylococcus aureus.</a> Molecular Cell. 32, 150 (2008).</li><li>Baban, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+Bacterial+Imaging+In+Vivo.">Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo.</a> J. Vis. Exp. (69), e4318 (2012).</li></ol>

In de hier beschreven werkwijzen aantal stappen zeer kritisch. We zullen deze hier benadrukken. Voor de isolatie van neutrofielen door dichtheidsgradiënt centrifugatie is het belangrijk om de lagen te verstoren tijdens of na de centrifugatiestappen. Wanneer opzuigen de neutrofielen met een plastic pipet, zorg ervoor dat niet aan de ballon te knijpen, terwijl in de laag van cellen, zal als het uitwerpen vloeistof de lagen te verstoren. Ook visueel de pellet van neutrofielen na de osmotische ...

Neutrofielen (PMN&#39;s) zijn professionele fagocyten die een belangrijke rol spelen bij de aangeboren immuunrespons tegen Staphylococcus aureus 1. De voortdurende strijd tussen gastheer en microbe heeft geleid tot een wapenwedloop van beide. Onlangs, community-geassocieerde (CA) stammen van meticilline resistente S. aureus (MRSA) naar voren zijn gekomen die lijken erg efficiënt te zijn in het omzeilen van neutrofielen doden 2,3. Overmatige fenol oplosbaar modulin (PSMs) productie van CA-MRSA is geassocieerd met hogere virulentie 4,5. Menselijke neutrofielen kunnen deze PSMs herkennen via FPR2 die leiden tot activering van deze G-eiwit gekoppelde receptor 6. Een van de vroegste gebeurtenissen is de mobilisatie van intracellulaire opslagplaatsen van calcium (Ca2 +). Ca 2 + fungeert als een tweede boodschapper voor verschillende effectorfuncties van PMNs waaronder degranulatie en fagocytose 7. Daarom Ca 2 + is een zeer gevoelige indicator van defunctionele capaciteit van PSMs aan PMN&#39;s te activeren. Om de effecten van PSMs op neutrofielen bestuderen, zijn verse neutrofielen geïsoleerd en geladen met een kleurstof die fluoresceert bij de mobilisatie van calcium. In een flowcytometrie experiment kan deze snelle mobilisatie worden gemeten. Met deze methode is het mogelijk om het directe effect van toxische en andere componenten op neutrofielen bestuderen en bepalen de laagste concentratie waarbij deze actief zijn. Voor ons, het is een zeer nuttig instrument om het effect van vele eiwitten geproduceerd door S. studeren aureus betrokken bij immuun ontduiking, zoals FPR2 remmend eiwit (FLIPR) 8, FLIPR-achtige 7, en Chemotaxis remmend eiwit van Staphylococcus aureus (CHIPS) 9. Al deze eiwitten aangetoond dat het calcium mobilisatie neutrofielen remt door binding aan de receptor herkennen van de agonist. Onlangs heeft onze groep beschreven die PSMs functioneel worden geremd door serum lipoproteïnen 10 &lt;/ Sup&gt;. Deze lipoproteïnen zijn overvloedig aanwezig in het bloed en menselijk weefsel, wat aangeeft dat PSMs oefenen hun functie voornamelijk in de intracellulaire omgeving. De beschikbaarheid van calcium mobilisatie assay toegestaan ​​om het effect van serum lipoproteïnen nauwkeurig te meten bij activering van neutrofielen door PSMs, aangegeven door de aanzienlijke remming door zeer lage concentraties serum. Aangezien de PSMs functioneel geremd door serum, veronderstelden we dat er een belangrijke functie voor PSMs als intracellulaire toxines. We hebben daarom getracht de rol van PSMs na fagocytose bepalen. Om de expressie van de PSMs in de intercellulaire ruimte te onderzoeken, hebben we reporter fusies van de promoter van het operon psmα GFP geconstrueerd. Wanneer deze reporter stammen van S. aureus werden gefagocyteerd door neutrofielen, werd de inductie van expressie waarneembaar met behulp van fluorescentie microscopie 10. Uiteraard is deze technique maakt het onderzoek mogelijk van de expressie van een groot aantal genen in S. aureus of andere ziekteverwekkers na fagocytose. Aangezien voor S. aureus overleven in de intercellulaire niche is zeer belangrijk om het aangeboren immuunsysteem 11 10 12 overwinnen, het bestuderen van de rol van genen geactiveerd in deze niche is zeer relevant voor het begrijpen van de virulentie.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-3, AM</td>
			<td>Molecular Probes / Life Technologies</td>
			<td>F-1241</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5442-03</td>
			<td>density 1.077 g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11191</td>
			<td>density 1.119 g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>52400-025</td>
			<td>contains 25 mM HEPES and L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, The Netherlands</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td>objective: HCX PL APO 40X/0.85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>Very important that the tube can be removed and replaced during the measurement process</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying interactions of staphylococcus aureus with neutrophils by flow cytometry and time lapse microscopy

We methode om het effect van fenol oplosbare modulins (PSMs) en andere toxinen geproduceerd en uitgescheiden door Staphylococcus aureus op neutrofielen bestuderen. Om de effecten van de PSMs op neutrofielen we isoleren verse neutrofielen behulp dichtheidsgradiëntcentrifugatie bestuderen. De neutrofielen worden geladen met een kleurstof die fluoresceert bij calcium mobilisatie. De activering van neutrofielen door PSMs initieert een snelle en voorbijgaande verhoging van de vrije intracellulaire calciumconcentratie. In een flow cytometrie experiment kan deze snelle mobilisatie gemeten door het volgen van de fluorescentie van een vooraf geladen kleurstof die reageert op de verhoogde concentratie vrije Ca 2 +. Met deze methode kunnen we de PSM concentratie nodig om de neutrofielen activeren, en meet de effecten van specifieke en algemene remmers van de neutrofiel activatie bepalen. Om de expressie van de PSMs onderzoeken in de intracellulaire ruimte, we reporter fusies van de promoter van het operon PSMα GFP geconstrueerd hebben. Wanneer deze reporter stammen van S. aureus gefagocyteerd door neutrofielen, kan de inductie van expressie worden waargenomen met behulp van fluorescentie microscopie.

Flow cytometrische assay voor de beoordeling van calcium mobilisatie in menselijke PMN Incuberen neutrofielen met een concentratie reeks synthetische PSMα3 resulteert in snelle activering zoals gemeten door calcium flux, die blijkt uit een toename van het signaal FL-1. Pre-incubatie van synthetische PSMα3 met 0,01%, 0,1% en 1% menselijk serum remde het vermogen om calcium fluxen (figuur 1) opwekken. Analyse van GFP expressie in bacteriën na fagocyto...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy at JoVE.com

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We methode om het effect van PSMs en andere toxines uitgescheiden door bestuderen<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Op neutrofielen behulp van flowcytometrie en fluorescentie microscopie.

Studeren Interacties van<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Met Neutrofielen door flowcytometrie en Time Lapse Microscopie

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Het gebruik van Drip Flow en roterende schijf reactoren voor Staphylococcus aureus Biofilm Analyse

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA

Subcutane Infectie van Methicilline Resistente Staphylococcus Aureus (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Growth met humaan hemoglobine als een ijzerbron

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Een eenvoudige en efficiënte methode om de Nucleaire Factor Activering Detect in menselijke neutrofielen door flowcytometrie

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Detectie van TL Nanoparticle Interacties met Primary Immune celtypes door flowcytometrie

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Beeldvorming van neutrofielen en monocyten in Mesenteriale Veins door Intravitale Microscopie op verdoofd muizen in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

genotypering van<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Door Ribosomaal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

Methodologie voor de studie van horizontale genoverdracht in<em&gt; Staphylococcus aureus</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolatie en In Vitro cultuur van lymfkliertest en menselijke alveolaire macrofagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Time-lapse 3D beeldvorming van fagocytose door macrofagen van de muis

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...