Name: studying interactions of staphylococcus aureus with neutrophils by flow cytometry and time lapse microscopy
Uploaded: 2013-07-17T13:00:00
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<p class="jove_content"&gt; RNは部分的に欧州共同体のセブンス枠組みプログラム、プロジェクト番号268324からマリー·キュリーの欧州再統合補助金（ERG）によって賄われていた。</p&gt;

1。密度遠心分離によるヒト血液からのPMNの分離<ol><li>ヘパリン加静脈血の星9 mlチューブを描画します。 </li><li>次のように二重の層フィコール勾配（5管の血のための4つの勾配）を準備：50 mlチューブで密度1.119グラム/ mlのフィコール溶液を12mlのその上に密度1.077グラム/ mlのフィコール溶液を注意深く層10ミリリットルを注ぐ。 </li><li> PBS等量の血液を希釈する。 </li><li>層のデュアルレイヤ?...

<ol>
	<li>Rigby, K. M., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+innate+host+defense+against+Staphylococcus+aureus+infections.">Neutrophils in innate host defense against Staphylococcus aureus infections.</a> Semin. Immunopathol. 34, 237-259 (2012).</li><li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+Mechanisms+Used+by+Staphylococcus+aureus+to+Avoid+Destruction+by+Human+Neutrophils.">Insights into Mechanisms Used by Staphylococcus aureus to Avoid Destruction by Human Neutrophils.</a> The Journal of Immunology. 175, 3907-3919 (2005).</li><li>Kobayashi, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+neutrophil+destruction+following+phagocytosis+of+Staphylococcus+aureus.">Rapid neutrophil destruction following phagocytosis of Staphylococcus aureus.</a> J. Innate Immun. 2, 560-575 (2010).</li><li>DeLeo, F. R., Otto, M., Kreiswirth, B. N., Chambers, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community-associated+meticillin-resistant+Staphylococcus+aureus.">Community-associated meticillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> The Lancet. 375, 1557 (2010).</li><li>David, M. Z., Daum, R. 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Immunol. 183, 6569-6578 (2009).</li><li>Prat, C., Bestebroer, J., de Haas, C. J. C., van Strijp, J. A. G., van Kessel, K. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Staphylococcal+Anti-Inflammatory+Protein+That+Antagonizes+the+Formyl+Peptide+Receptor-Like+1.">A New Staphylococcal Anti-Inflammatory Protein That Antagonizes the Formyl Peptide Receptor-Like 1.</a> The Journal of Immunology. 177, 8017-8026 (2006).</li><li>de Haas, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+inhibitory+protein+of+Staphylococcus+aureus,+a+bacterial+antiinflammatory+agent.">Chemotaxis inhibitory protein of Staphylococcus aureus, a bacterial antiinflammatory agent.</a> The Journal of Experimental Medicine. 199, 687-695 (2004).</li><li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+Staphylococcal+Phenol+Soluble+Modulins+by+Serum+Lipoprotein+Particles.">Inactivation of Staphylococcal Phenol Soluble Modulins by Serum Lipoprotein Particles.</a> PLoS Pathog. 8, e1002606 (2012).</li><li>Kubica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Potential+New+Pathway+for+Staphylococcus+aureus+Dissemination:+The+Silent+Survival+of+S.+aureus+Phagocytosed+by+Human+Monocyte-Derived+Macrophages.">A Potential New Pathway for Staphylococcus aureus Dissemination: The Silent Survival of S. aureus Phagocytosed by Human Monocyte-Derived Macrophages.</a> PLoS ONE. 3, e1409 (2008).</li><li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+alpha-phenol+soluble+modulins+contribute+to+neutrophil+lysis+after+phagocytosis.">Staphylococcal alpha-phenol soluble modulins contribute to neutrophil lysis after phagocytosis.</a> Cellular Microbiology. , (2013).</li><li>Queck, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAIII-Independent+Target+Gene+Control+by+the+agr+Quorum-Sensing+System:+Insight+into+the+Evolution+of+Virulence+Regulation+in+Staphylococcus+aureus.">RNAIII-Independent Target Gene Control by the agr Quorum-Sensing System: Insight into the Evolution of Virulence Regulation in Staphylococcus aureus.</a> Molecular Cell. 32, 150 (2008).</li><li>Baban, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+Bacterial+Imaging+In+Vivo.">Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo.</a> J. Vis. Exp. (69), e4318 (2012).</li></ol>

ここで説明する方法では、いくつかのステップは非常に重要です。ここでは、これらをハイライト表示さ​​れます。 密度勾配遠心分離により好中球の単離のためには、遠心分離ステップの間または後に層を妨げないことが重要である。プラスチックピペットを用いて好中球を吸引すると、液体を吐出するレイヤーを邪魔するように、細胞の層の中に風船を圧迫しない?...

好中球（PMNは）は、 黄色ブドウ球菌 1に対する自然免疫応答において重要な役割を果たす専門の食細胞である。宿主と微生物の間に一定の戦いは双方の軍備競争につながっている。メチシリン耐性S.の最近では、コミュニティ関連（CA）の株黄色ブドウ球菌 （MRSA）は、好中球の殺害2,3の回避は非常に効率的であるように見えることが浮上している。 CA-MRSAの過剰フェノール可溶性のモジュリン（のPSM）生産は4,5高病原性と関連している。ヒト好中球は、このGタンパク質共役受容体6の活性化につながるFPR2を介してこれらのPSMを認識することができます。最古のいずれかのイベントは、カルシウムの細胞内貯蔵（のCa 2 +）の動員である。 Ca 2 +の脱顆粒と貪食7を含めたPMNのエフェクター機能の様々な二次メッセンジャーとして機能します。したがってのCa 2 +の非常に敏感な指標であるたPMNを活性化するためのPSMの機能的能力。好中球上のPSMの効果を研究するために、新鮮な好中球がカルシウム動員により蛍光を発する色素を分離し、ロードされます。フローサイトメトリー実験で急速な動員を測定することができる。この方法を使用すると、好中に有毒で他の成分の直接的な影響を検討し、これらがアクティブである最低濃度を決定することができる。私たちにとって、それはS.によって生成された多くのタンパク質の効果を研究するための非常に便利なツールです黄色ブドウ球菌は、そのようなFPR2阻害タンパク質（FLIPR）8、7 FLIPRような、および黄色ブドウ球菌 （CHIPS）9の走化性阻害タンパク質として免疫回避に関与。すべてのこれらのタンパク質は、アゴニストを認識する受容体に結合することにより、好中球カルシウム動員を阻害することが示されている。 最近では、私たちのグループはのPSMは機能10血清リポタンパク質によって阻害されていることを説明した&lt;/&gt;（商標）。これらのリポタンパク質は、PSMは、主に細胞内環境でその機能を発揮することを示し、血液や人体組織内に豊富に存在している。カルシウム動員アッセイの有用性は、血清の非常に低濃度でかなりの阻害によって示されるように、私たちは正確にのPSMによる好中球の活性化に血清リポタンパク質の効果を測定することができました。 PSMは、機能的には、血清によって阻害されるので、細胞内毒素としてのPSMための重要な機能があるという仮説を立てた。したがって、我々は貪食後のPSMの役割を決定しようとした。細胞間隙でのPSMの発現を調べるために、我々は、GFPにpsmαオペロンのプロモーターのレポーター融合を構築した。ときS.これらのレポーター株黄色ブドウ球菌は、好中球によって貪食された、発現の誘導を、蛍光顕微鏡10を用いて観測した。明らかに、このTEChniqueはS.で多数の遺伝子の発現の研究を可能にする貪食後に黄色ブドウ球菌や他の病原体。 S.のために導入されたバージョン細胞間のニッチで生き残る球菌は 11 10 12自然免疫系を克服するために非常に重要であり、このニッチで活性化する遺伝子の役割を研究すると、その病原性を理解することに非常に関連しています。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-3, AM</td>
			<td>Molecular Probes / Life Technologies</td>
			<td>F-1241</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5442-03</td>
			<td>density 1.077 g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11191</td>
			<td>density 1.119 g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>52400-025</td>
			<td>contains 25 mM HEPES and L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, The Netherlands</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td>objective: HCX PL APO 40X/0.85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>Very important that the tube can be removed and replaced during the measurement process</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying interactions of staphylococcus aureus with neutrophils by flow cytometry and time lapse microscopy

私たちは、好中球上の黄色ブドウ球菌によって産生され、分泌されるフェノール可溶性のmodulins（PSMが）や他の毒素の影響を研究するための方法を提示する。我々は、密度勾配遠心分離を使用した新鮮な好中球を分離した好中球上のPSMの効果を研究する。これらの好中球は、カルシウム動員により蛍光を発する色素でロードされます。 PSMはによって好中球の活性化は、自由細胞内カルシウム濃度の急激かつ一過性の上昇を開始します。フローサイトメトリー実験で急速な動員は、遊離Ca 2 +濃度の増加に反応プリロードされた色素の蛍光をモニターすることによって測定することができる。この方法で用いて、我々は、好中球を活性化し、好中球活性化の特異的かつ一般的な阻害剤の効果を測定する必要がPSMの濃度を決定することができる。 細胞内空間、WでのPSMの発現を調べるために、電子GFPへPSMαオペロンのプロモーターのレポーター融合を構築した。ときS.これらのレポーター株黄色ブドウ球菌は、好中球によって貪食され、発現の誘導は、蛍光顕微鏡を用いて観察することができる。

人間のPMNの内カルシウム動員の評価のためのフローサイトメトリーアッセイ FL-1におけるシグナルの増加によって示されるカルシウム流入によって測定されるように急速な活性化をもたらす合成PSMα3の濃度一連の好中球をインキュベートする。 0.01％で合成PSMα3のプレインキュベーション、0.1％または1％のヒト血清が大幅カルシウムフラックス（ 図1）を誘発す...

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Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

我々はによって分泌のPSMや他の毒素の影響を研究するための方法を提示<em&gt;黄色ブドウ球菌</emフローサイトメトリー、蛍光顕微鏡を用いて好中球&gt;。

の相互作用を研究<em&gt;黄色ブドウ球菌</em&gt;フローサイトメトリーとタイムラプス顕微鏡による好中球と

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

用ドリップ流れと回転円板の原子炉の使用黄色ブドウ球菌バイオフィルム分析

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA

メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）の皮下感染

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

鉄源としてヒトヘモグロビンを用いた黄色ブドウ球菌の成長

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

フローサイトメトリーによるヒト好中球の核因子の活性を検出するために簡単で効率的な方法

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

フローサイトメトリーによる一次免疫細胞亜集団との蛍光ナノ粒子の相互作用を検出

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

リアルタイムで麻酔したマウスに生体顕微鏡により腸間膜静脈に好中球および単球のイメージング

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

のジェノタイピング<em&gt;黄色ブドウ球菌</em&gt;によってリボソームスペーサーPCR（RS-PCR）

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

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で水平遺伝子伝達の研究のための方法論<em&gt;黄色ブドウ球菌</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

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離とマウスとヒトの肺胞マクロファージの体外培養

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

マウスのマクロファージによる貪食のコマ撮りの 3 D イメージング

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...