Name: studying interactions of staphylococcus aureus with neutrophils by flow cytometry and time lapse microscopy
Uploaded: 2013-07-17T13:00:00
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<p class="jove_content"&gt; RN 부분적으로 유럽 연합의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램, 프로젝트 번호 268324에서 마리 퀴리 유럽의 재 통합 보조금 (ERG)에 의해 재정 지원되었다.</p&gt;

1. 밀도 원심 분리하여 인간의 혈액에서 PMNs의 분리 <ol><li> 헤파린 정맥 혈액의 3.5 9 ML 튜브를 그립니다. </li><li> 다음과 같이 듀얼 레이어 Ficoll 그라디언트 (5 관 혈액 4 그라디언트) 준비 : 50 ML 튜브의 밀도 1.119 g / ㎖ ficoll 용액 12 mL를 상단에 밀도 1.077 g / ㎖ ficoll 솔루션 조심스럽게 층을 10 ㎖를 붓고. </li><li> PBS의 동일한 볼륨 혈액을 희석. </li><li> 레이어 듀얼 레이어 Ficoll 기울기에주의 희석 된 ?...

<ol>
	<li>Rigby, K. M., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+innate+host+defense+against+Staphylococcus+aureus+infections.">Neutrophils in innate host defense against Staphylococcus aureus infections.</a> Semin. Immunopathol. 34, 237-259 (2012).</li><li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+Mechanisms+Used+by+Staphylococcus+aureus+to+Avoid+Destruction+by+Human+Neutrophils.">Insights into Mechanisms Used by Staphylococcus aureus to Avoid Destruction by Human Neutrophils.</a> The Journal of Immunology. 175, 3907-3919 (2005).</li><li>Kobayashi, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+neutrophil+destruction+following+phagocytosis+of+Staphylococcus+aureus.">Rapid neutrophil destruction following phagocytosis of Staphylococcus aureus.</a> J. Innate Immun. 2, 560-575 (2010).</li><li>DeLeo, F. R., Otto, M., Kreiswirth, B. N., Chambers, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community-associated+meticillin-resistant+Staphylococcus+aureus.">Community-associated meticillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> The Lancet. 375, 1557 (2010).</li><li>David, M. Z., Daum, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community-Associated+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus:+Epidemiology+and+Clinical+Consequences+of+an+Emerging+Epidemic.">Community-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: Epidemiology and Clinical Consequences of an Emerging Epidemic.</a> Clinical Microbiology Reviews. 23, 616-687 (2010).</li><li>Kretschmer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Formyl+Peptide+Receptor+2+Senses+Highly+Pathogenic+Staphylococcus+aureus.">Human Formyl Peptide Receptor 2 Senses Highly Pathogenic Staphylococcus aureus.</a> Cell Host &amp; Microbe. 7, 463 (2010).</li><li>Prat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+homolog+of+formyl+peptide+receptor-like+1+(FPRL1)+inhibitor+from+Staphylococcus+aureus+(FPRL1+inhibitory+protein)+that+inhibits+FPRL1+and+FPR.">A homolog of formyl peptide receptor-like 1 (FPRL1) inhibitor from Staphylococcus aureus (FPRL1 inhibitory protein) that inhibits FPRL1 and FPR.</a> J. Immunol. 183, 6569-6578 (2009).</li><li>Prat, C., Bestebroer, J., de Haas, C. J. C., van Strijp, J. A. G., van Kessel, K. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Staphylococcal+Anti-Inflammatory+Protein+That+Antagonizes+the+Formyl+Peptide+Receptor-Like+1.">A New Staphylococcal Anti-Inflammatory Protein That Antagonizes the Formyl Peptide Receptor-Like 1.</a> The Journal of Immunology. 177, 8017-8026 (2006).</li><li>de Haas, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+inhibitory+protein+of+Staphylococcus+aureus,+a+bacterial+antiinflammatory+agent.">Chemotaxis inhibitory protein of Staphylococcus aureus, a bacterial antiinflammatory agent.</a> The Journal of Experimental Medicine. 199, 687-695 (2004).</li><li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+Staphylococcal+Phenol+Soluble+Modulins+by+Serum+Lipoprotein+Particles.">Inactivation of Staphylococcal Phenol Soluble Modulins by Serum Lipoprotein Particles.</a> PLoS Pathog. 8, e1002606 (2012).</li><li>Kubica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Potential+New+Pathway+for+Staphylococcus+aureus+Dissemination:+The+Silent+Survival+of+S.+aureus+Phagocytosed+by+Human+Monocyte-Derived+Macrophages.">A Potential New Pathway for Staphylococcus aureus Dissemination: The Silent Survival of S. aureus Phagocytosed by Human Monocyte-Derived Macrophages.</a> PLoS ONE. 3, e1409 (2008).</li><li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+alpha-phenol+soluble+modulins+contribute+to+neutrophil+lysis+after+phagocytosis.">Staphylococcal alpha-phenol soluble modulins contribute to neutrophil lysis after phagocytosis.</a> Cellular Microbiology. , (2013).</li><li>Queck, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAIII-Independent+Target+Gene+Control+by+the+agr+Quorum-Sensing+System:+Insight+into+the+Evolution+of+Virulence+Regulation+in+Staphylococcus+aureus.">RNAIII-Independent Target Gene Control by the agr Quorum-Sensing System: Insight into the Evolution of Virulence Regulation in Staphylococcus aureus.</a> Molecular Cell. 32, 150 (2008).</li><li>Baban, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+Bacterial+Imaging+In+Vivo.">Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo.</a> J. Vis. Exp. (69), e4318 (2012).</li></ol>

여기에 설명 된 방법에 몇 가지 단계가 매우 중요합니다. 우리는 여기서이 강조 표시됩니다. 밀도 기울기 원심 분리하여 호중구의 분리의 경우는 원심 분리 단계 도중 또는 이후 레이어를 방해하지 않는 것이 중요합니다. 플라스틱 피펫을 사용하여 호중구를 흡입 할 때, 세포의 층에서 동안으로 배출 액체 층을 방해 할 풍선을 짜내하지 있는지 확인하십시오. 또한, 시각적으?...

호중구 (PMNs)는 황색 포도상 구균 1에 타고난 면역 반응에 중요한 역할을 전문가 식세포이다. 호스트 및 미생물 사이의 지속적인 전투는 양쪽의 군비 경쟁을 주도하고있다. meticillin 내성 S.의 최근 사회 관련 (CA) 균주 구균 (MRSA)은 호중구 살해 2,3의 우회에 매우 효율적있을 것 등장했습니다. CA-MRSA의 과도한 페놀 용해 modulin (PSMS) 생산은 4,5 높은 독성과 관련되어있다. 인간 호중구 수용체 6 결합이 G-단백질의 활성화로 이어질 FPR2를 통해 이러한 PSMS를 인식 할 수 있습니다. 최초의 이벤트 중 하나는 칼슘의 세포 내 저장 (칼슘 2 +)의 동원이다. 칼슘 2 + 탈과립 및 식균 7 등 PMNs의 이펙터 기능의 다양한 보조 메신저 역할을합니다. 따라서 칼슘 2 +의 매우 중요한 지표이다PMNs를 활성화 PSMS의 기능 용량. 호중구에 PSMS의 효과를 연구하기 위해 신선한 호중구는 칼슘 동원에 형광하는 염료로 고립로드됩니다. 유동 세포 계측법 실험이 신속하게 동원은 측정 할 수 있습니다. 이 방법을 사용하면, 호중구에 대한 독성 및 기타 구성 요소의 직접적인 효과를 연구하고, 이러한 활성화 된 가장 낮은 농도를 측정 할 수 있습니다. 우리를 위해, 그것은 S.에 의해 만들어진 여러 단백질의 효과를 연구하기 위해 매우 유용한 도구입니다 구균은 FPR2 억제 단백질 (FLIPr) 8, 7 FLIPr 같은, 그리고 황색 포도상 구균 (CHIPS) 9 주 화성 억제 단백질로 면역 회피에 참여. 이러한 모든 단백질은 작용제를 인식 수용체에 결합하여 호중구의 칼슘 동원을 억제하기 위해 표시되었습니다. 최근 우리 그룹은 PSMS가 기능적으로 10 혈청 지질 단백질에 의해 억제되는 것을 설명하고있다 &lt;/&gt;을 먹다. 이 지단백은 PSMS 주로 세포 내 환경에서 그 기능을 발휘을 나타내는 혈액과 인체 조직 내에 다량으로 존재한다. 칼슘 동원 분석의 가용성은 우리가 정확하게 혈청의 매우 낮은 농도로 상당한 억제에 표시된 PSMS에 의한 호중구의 활성화에 혈청 지단백의 효과를 측정 할 수있었습니다. PSMS가 기능적으로 혈청에 의해 억제되기 때문에, 우리는 세포 내 독소 PSMS위한 중요한 기능이 있다는 가설을 세웠다. 따라서 우리는 식균 작용 후 PSMS의 역할을 결정하는 모색. 세포 사이 공간에 PSMS의 발현을 조사하기 위해, 우리는 GFP의 psmα 오페론의 프로모터의 기자 융합을 건설했다. 언제 S. 이러한 기자 변종 구균은 호중구에 의해 phagocytosed 세포했다, 표현의 유도는 형광 현미경 10을 사용하여 관찰 하였다. 물론이 절반hnique은 S.의 유전자의 다수의 표현의 연구를 수 식균 작용 후 구균이나 다른 병원균. S.에 대한 이후 간 틈새 시장에서 살아 남기 구균이 틈새 시장에서 활성화 유전자의 역할을 공부 타고난 면역 시스템 11 10 12를 극복하는 것이 매우 중요하다 그 독성을 이해하는 매우 관련이 있습니다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-3, AM</td>
			<td>Molecular Probes / Life Technologies</td>
			<td>F-1241</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5442-03</td>
			<td>density 1.077 g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11191</td>
			<td>density 1.119 g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>52400-025</td>
			<td>contains 25 mM HEPES and L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, The Netherlands</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td>objective: HCX PL APO 40X/0.85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>Very important that the tube can be removed and replaced during the measurement process</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying interactions of staphylococcus aureus with neutrophils by flow cytometry and time lapse microscopy

우리는 호중구에서 황색 포도상 구균에 의해 생산 분비 페놀 용해 modulins (PSMS) 및 기타 독소의 효과를 연구하는 방법을 제시한다. 우리는 밀도 기울기 원심 분리를 사용하여 신선한 호중구를 분리 호중구에 PSMS의 효과를 연구합니다. 이러한 호중구는 칼슘 동원에 형광 염료로로드됩니다. PSMS에 의한 호중구의 활성화는 무료로 세포 내 칼슘 농도의 신속하고 일시적인 증가를 시작합니다. 유동 세포 계측법 실험이 신속하게 동원은 무료 칼슘의 증가 농도 +에 반응하는 사전로드 된 염료의 형광을 모니터링하여 측정 할 수 있습니다. 이 방법을 사용 우리는 호중구를 활성화하고 호중구 활성화의 특정 및 일반 억제제의 효과를 측정하는 데 필요한 PSM 농도를 확인할 수 있습니다. 세포 내 공간 W에 PSMS의 발현을 조사하기전자 GFP에 PSMα 오페론의 프로모터의 기자 융합을 건설했다. 언제 S. 이러한 기자 변종 구균은 호중구에 의해 phagocytosed 세포 아르, 표현의 유도는 형광 현미경을 사용하여 관찰 할 수있다.

인간의 PMNs 칼슘 동원의 평가를위한 유세포 분석 FL-1 신호의 증가에 의해 표시되는 칼슘 플럭스에 의해 측정 급속한 활성화의 결과로 합성 PSMα3의 농도 일련의 호중구을 배양. 0.01 %의 합성 PSMα3의 사전 배양, 0.1 % 또는 1 % 혈청이 크게 칼슘 플럭스 (그림 1)을 유도 할 수있는 능력을 저해. 형광 현미경을 사용하여 PMNs하여 식균 작용 후 박테리아 GFP...

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Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

우리는에 의해 분비 PSMS 및 기타 독소의 효과를 연구하는 방법을 제시<em&gt; 황색 포도상 구균</em&gt; 유동 세포 계측법 및 형광 현미경을 사용하여 호중구합니다.

의 상호 작용을 연구<em&gt; 황색 포도상 구균</em&gt; 유동 세포 계측법 및 시간 경과 현미경에 의한 호중구와

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

에 대한 드립 흐름 및 회전 디스크 원자로의 사용 포도상 구균 Biofilm 분석

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

연구

면역학 및 감염병학

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA

Methicillin 내성 황색 포도상 구균 아리 어스의 피하 감염 (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

철 소스로 인간 혈색소를 사용하여 황색 포도상 구균 성장

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

유동 세포 계측법에 의해 인간 호중구에 핵 팩터 활성화를 감지 할 간단하고 효율적인 방법

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

유동 세포 계측법에 의해 주요 면역 세포 모집단과 형광 나노 입자의 상호 작용의 검출

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

실시간으로 마취 마우스에 생체 내에 현미경으로 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구 이미징

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

의 유전자형<em&gt; 황색 포도상 구균</em&gt;에 의해 리보솜 스페이서 PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

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수평 유전자 전달의 연구에 대한 방법론<em&gt; 황색 포도상 구균</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

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고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

마우스 대 식 세포에 의해 식 균 작용의 시간 경과 3D 영상

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...