Name: studying interactions of staphylococcus aureus with neutrophils by flow cytometry and time lapse microscopy
Uploaded: 2013-07-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy at JoVE.com

<p class="jove_content"&gt; RN ble delvis finansiert av et Marie Curie europeiske Re-integrasjon Grants (ERG) fra Det europeiske fellesskaps sjuende rammeprogram, prosjektnummer 268324.</p&gt;

En. Isolering av PMN fra humant blod etter Tetthet Sentrifugering <ol><li> Tegn 5 9 ml rør av heparinisert venøs blod. </li><li> Forbered tolags Ficoll gradienter (4 gradienter for 5 rør blod) som følger: Hell 12 ml av en densitet 1,119 g / ml Ficoll-løsning i et 50 ml rør og forsiktig lag 10 ml av en densitet 1,077 g / ml Ficoll løsning på toppen. </li><li> Fortynn blodet med et like stort volum av PBS. </li><li> Lag fortynnet blod nøye på dual layer Ficoll gradient, 20-25 ml per gradient. </li><li> Sentrif...

<ol>
	<li>Rigby, K. M., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+innate+host+defense+against+Staphylococcus+aureus+infections.">Neutrophils in innate host defense against Staphylococcus aureus infections.</a> Semin. Immunopathol. 34, 237-259 (2012).</li><li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+Mechanisms+Used+by+Staphylococcus+aureus+to+Avoid+Destruction+by+Human+Neutrophils.">Insights into Mechanisms Used by Staphylococcus aureus to Avoid Destruction by Human Neutrophils.</a> The Journal of Immunology. 175, 3907-3919 (2005).</li><li>Kobayashi, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+neutrophil+destruction+following+phagocytosis+of+Staphylococcus+aureus.">Rapid neutrophil destruction following phagocytosis of Staphylococcus aureus.</a> J. Innate Immun. 2, 560-575 (2010).</li><li>DeLeo, F. R., Otto, M., Kreiswirth, B. N., Chambers, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community-associated+meticillin-resistant+Staphylococcus+aureus.">Community-associated meticillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> The Lancet. 375, 1557 (2010).</li><li>David, M. Z., Daum, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community-Associated+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus:+Epidemiology+and+Clinical+Consequences+of+an+Emerging+Epidemic.">Community-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: Epidemiology and Clinical Consequences of an Emerging Epidemic.</a> Clinical Microbiology Reviews. 23, 616-687 (2010).</li><li>Kretschmer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Formyl+Peptide+Receptor+2+Senses+Highly+Pathogenic+Staphylococcus+aureus.">Human Formyl Peptide Receptor 2 Senses Highly Pathogenic Staphylococcus aureus.</a> Cell Host &amp; Microbe. 7, 463 (2010).</li><li>Prat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+homolog+of+formyl+peptide+receptor-like+1+(FPRL1)+inhibitor+from+Staphylococcus+aureus+(FPRL1+inhibitory+protein)+that+inhibits+FPRL1+and+FPR.">A homolog of formyl peptide receptor-like 1 (FPRL1) inhibitor from Staphylococcus aureus (FPRL1 inhibitory protein) that inhibits FPRL1 and FPR.</a> J. Immunol. 183, 6569-6578 (2009).</li><li>Prat, C., Bestebroer, J., de Haas, C. J. C., van Strijp, J. A. G., van Kessel, K. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Staphylococcal+Anti-Inflammatory+Protein+That+Antagonizes+the+Formyl+Peptide+Receptor-Like+1.">A New Staphylococcal Anti-Inflammatory Protein That Antagonizes the Formyl Peptide Receptor-Like 1.</a> The Journal of Immunology. 177, 8017-8026 (2006).</li><li>de Haas, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+inhibitory+protein+of+Staphylococcus+aureus,+a+bacterial+antiinflammatory+agent.">Chemotaxis inhibitory protein of Staphylococcus aureus, a bacterial antiinflammatory agent.</a> The Journal of Experimental Medicine. 199, 687-695 (2004).</li><li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+Staphylococcal+Phenol+Soluble+Modulins+by+Serum+Lipoprotein+Particles.">Inactivation of Staphylococcal Phenol Soluble Modulins by Serum Lipoprotein Particles.</a> PLoS Pathog. 8, e1002606 (2012).</li><li>Kubica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Potential+New+Pathway+for+Staphylococcus+aureus+Dissemination:+The+Silent+Survival+of+S.+aureus+Phagocytosed+by+Human+Monocyte-Derived+Macrophages.">A Potential New Pathway for Staphylococcus aureus Dissemination: The Silent Survival of S. aureus Phagocytosed by Human Monocyte-Derived Macrophages.</a> PLoS ONE. 3, e1409 (2008).</li><li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+alpha-phenol+soluble+modulins+contribute+to+neutrophil+lysis+after+phagocytosis.">Staphylococcal alpha-phenol soluble modulins contribute to neutrophil lysis after phagocytosis.</a> Cellular Microbiology. , (2013).</li><li>Queck, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAIII-Independent+Target+Gene+Control+by+the+agr+Quorum-Sensing+System:+Insight+into+the+Evolution+of+Virulence+Regulation+in+Staphylococcus+aureus.">RNAIII-Independent Target Gene Control by the agr Quorum-Sensing System: Insight into the Evolution of Virulence Regulation in Staphylococcus aureus.</a> Molecular Cell. 32, 150 (2008).</li><li>Baban, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+Bacterial+Imaging+In+Vivo.">Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo.</a> J. Vis. Exp. (69), e4318 (2012).</li></ol>

I de fremgangsmåter som er beskrevet her noen trinn er meget kritisk. Vi vil markere disse her. For isolering av nøytrofiler ved densitets-gradientsentrifugering er det viktig ikke å forstyrre lagene under eller etter sentrifugeringen trinn. Når aspirere de nøytrofile bruker en plast pipette, sørg for ikke å presse ballongen mens i lag med celler, vil som løser ut væske forstyrre lagene. Også visuelt inspisere pellet av nøytrofile etter osmotisk sjokk og sentrifugering trinn. Ders...

Nøytrofile (PMN) er profesjonelle fagocytter som spiller en nøkkelrolle i det medfødte immunforsvaret mot Staphylococcus aureus en. Den konstante kampen mellom vert og mikrobe har ført til et våpenkappløp av begge. Nylig, community-tilknyttede (CA) stammer av Meticillin resistente S. aureus (MRSA) har dukket opp som ser ut til å være svært effektiv i omgåelse av nøytrofile drapet 2,3. Overdreven fenol løselig modulin (PSMS) produksjon av CA-MRSA har vært forbundet med høyere virulens 4,5. Menneskelige nøytrofile kan gjenkjenne disse PSMS via FPR2 som fører til aktivering av denne G-protein koblet reseptor seks. En av de tidligste begivenheter er mobiliseringen av intracellulære lagre av kalsium (Ca2 +). Ca 2 + fungerer som en sekundær budbringer for en rekke effektor funksjoner av PMN inkludert degranulering og fagocytose 7.. Derfor Ca 2 + er en svært følsom indikator påfunksjonell kapasitet på PSMS å aktivere PMN. Å studere effekter av PSMS på nøytrofile, er friske nøytrofile isolert og lastet med et fargestoff som fluoresces på kalsium mobilisering. I en flowcytometri eksperiment denne rask mobilisering kan måles. Ved hjelp av denne metode, er det mulig å studere de direkte effektene av giftige og andre komponenter på neutrofiler, og bestemme den laveste konsentrasjon ved hvilken disse er aktive. For oss er det et svært nyttig verktøy for å studere effekten av mange proteiner som produseres av S. aureus involvert i immune unndragelse, for eksempel FPR2 hemmende protein (FLIPR) 8, FLIPR-aktig 7, og Chemotaxis hemmende protein av Staphylococcus aureus (CHIPS) 9. Alle disse proteiner har blitt vist å hemme kalsium-mobilisering i neutrofiler ved å binde til reseptoren gjenkjenne agonisten. Nylig har vår gruppe beskrevet som PSMS er funksjonelt hemmet av serum lipoproteiner 10 &lt;/ Sup&gt;. Disse lipoproteiner er rikelig tilstede i blod og vev fra mennesker, som indikerer at PSMS utøve sin funksjon i første rekke i den intracellulære miljøet. Tilgjengeligheten av kalsium-mobilisering analysen tillater oss å nøyaktig måle effekten av serum lipoproteiner på aktivering av nøytrofiler ved PSMS, angitt med betydelig hemning ved meget lave konsentrasjoner av serum. Siden PSMS er funksjonelt inhiberes av serum, hypotese vi at det er en viktig funksjon for PSMS som intracellulære giftstoffer. Vi har derfor forsøkt å finne ut hvilken rolle PSMS etter fagocytose. For å undersøke uttrykket av PSMS i intracellulære plass, har vi bygget reporter fusjoner av arrangøren av den psmα operon til GFP. Når disse reporter stammer av S. aureus ble phagocytosed av nøytrofile ble induksjon av uttrykket observerbar med fluorescens mikroskopi 10. Selvfølgelig, dette technique tillater undersøkelse av ekspresjonen av et stort antall gener i S. aureus eller andre patogener etter fagocytose. Siden for S. aureus overleve i det intracellulære nisje er svært viktig for å overvinne det medfødte immunsystemet 11 10 12, studere rollen til gener aktiveres i denne nisjen er svært relevant for å forstå dens virulens.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-3, AM</td>
			<td>Molecular Probes / Life Technologies</td>
			<td>F-1241</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5442-03</td>
			<td>density 1.077 g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11191</td>
			<td>density 1.119 g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>52400-025</td>
			<td>contains 25 mM HEPES and L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, The Netherlands</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td>objective: HCX PL APO 40X/0.85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>Very important that the tube can be removed and replaced during the measurement process</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying interactions of staphylococcus aureus with neutrophils by flow cytometry and time lapse microscopy

Vi presenterer metoder for å studere effekten av fenol oppløselige modulins (PSMS) og andre giftstoffer som produseres og utskilles av Staphylococcus aureus på neutrofiler. For å studere effektene av de PSMS på Neutrofilene Isoler ferske nøytrofiler ved hjelp av tetthetsgradient-sentrifugering. Disse nøytrofile er lastet med et fargestoff som fluoresces på kalsium mobilisering. Aktivering av nøytrofiler ved PSMS initierer en rask og forbigående økning i fritt intracellulært kalsium-konsentrasjon. I en flowcytometri eksperiment denne rask mobilisering kan måles ved å overvåke fluorescensen av et forhåndslastet fargestoff som reagerer på den økte konsentrasjonen av fri Ca2 +. Ved hjelp av denne metoden kan vi bestemme PSM konsentrasjonen som er nødvendig for å aktivere nøytrofile, og måle effekten av spesifikke og generelle hemmere av nøytrofile aktivering. For å undersøke uttrykket av PSMS i den intracellulære plass, we har konstruert reporter fusjoner av arrangøren av den PSMα operon til GFP. Når disse reporter stammer av S. aureus er phagocytosed av nøytrofile, kan induksjon av uttrykket observeres med fluorescens mikroskopi.

Flowcytometrisk analysen for vurdering av kalsium mobilisering i menneskelige PMN Inkubering av neutrofiler med en konsentrasjon serie av syntetiske PSMα3 resulterer i hurtig aktivering målt ved kalsium-fluks, som er vist ved en økning i signalet i FL-1. Pre-inkubasjon av syntetisk PSMα3 med 0,01%, 0,1% eller 1% humant serum inhiberte signifikant evne til å fremkalle kalsium-flukser (figur 1). Analyse av GFP uttrykk i bakterier etter fagocytose av...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy at JoVE.com

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Vi presenterer metoder for å studere effekten av PSMS og andre giftstoffer utskilt av<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; På nøytrofile med flowcytometri og fluorescens mikroskopi.

Studerer Samhandling av<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Med Neutrophils ved flowcytometri og Time Lapse Mikroskopi

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Vekst med humant hemoglobin som en Iron Source

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

En enkel og effektiv metode for å oppdage kjernefysiske faktor Activation i Human Nøytrofile ved flowcytometri

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Påvisning av Fluorescent Nanoparticle Interaksjoner med Primær immun celle subpopulasjoner av flowcytometri

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Imaging Neutrofiler og monocytter i mesenterisk Veins av intraMikros på bedøvet Mus i sanntid

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

genotyping av<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; av Ribosomalt Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

Metodikk for studier av horisontal genoverføring i<em&gt; Staphylococcus aureus</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolasjon og In Vitro kultur Murine og menneskelig Alveolar makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Tidsinnstilt 3D bildebehandling av fagocytose av musen makrofager

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...