Name: studying interactions of staphylococcus aureus with neutrophils by flow cytometry and time lapse microscopy
Uploaded: 2013-07-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy at JoVE.com

<p class="jove_content"&gt; RN был частично финансируется за счет Марии Кюри европейские Re-интеграции грантов (ERG) из Седьмая рамочная Европейского Сообщества Программой, номером проекта 268324.</p&gt;

1. Выделение PMNs из крови человека по центрифугирование в градиенте плотности <ol><li> Draw 5 9 мл пробирках из гепаринизированной венозной крови. </li><li> Подготовьте двойной слой Ficoll градиенты (4 градиентов для +5 пробирки для крови) в качестве следующим образом: заливают 12 мл от плотности, +1,119 г /...

<ol>
	<li>Rigby, K. M., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+innate+host+defense+against+Staphylococcus+aureus+infections.">Neutrophils in innate host defense against Staphylococcus aureus infections.</a> Semin. Immunopathol. 34, 237-259 (2012).</li><li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+Mechanisms+Used+by+Staphylococcus+aureus+to+Avoid+Destruction+by+Human+Neutrophils.">Insights into Mechanisms Used by Staphylococcus aureus to Avoid Destruction by Human Neutrophils.</a> The Journal of Immunology. 175, 3907-3919 (2005).</li><li>Kobayashi, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+neutrophil+destruction+following+phagocytosis+of+Staphylococcus+aureus.">Rapid neutrophil destruction following phagocytosis of Staphylococcus aureus.</a> J. Innate Immun. 2, 560-575 (2010).</li><li>DeLeo, F. R., Otto, M., Kreiswirth, B. N., Chambers, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community-associated+meticillin-resistant+Staphylococcus+aureus.">Community-associated meticillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> The Lancet. 375, 1557 (2010).</li><li>David, M. Z., Daum, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community-Associated+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus:+Epidemiology+and+Clinical+Consequences+of+an+Emerging+Epidemic.">Community-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: Epidemiology and Clinical Consequences of an Emerging Epidemic.</a> Clinical Microbiology Reviews. 23, 616-687 (2010).</li><li>Kretschmer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Formyl+Peptide+Receptor+2+Senses+Highly+Pathogenic+Staphylococcus+aureus.">Human Formyl Peptide Receptor 2 Senses Highly Pathogenic Staphylococcus aureus.</a> Cell Host &amp; Microbe. 7, 463 (2010).</li><li>Prat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+homolog+of+formyl+peptide+receptor-like+1+(FPRL1)+inhibitor+from+Staphylococcus+aureus+(FPRL1+inhibitory+protein)+that+inhibits+FPRL1+and+FPR.">A homolog of formyl peptide receptor-like 1 (FPRL1) inhibitor from Staphylococcus aureus (FPRL1 inhibitory protein) that inhibits FPRL1 and FPR.</a> J. Immunol. 183, 6569-6578 (2009).</li><li>Prat, C., Bestebroer, J., de Haas, C. J. C., van Strijp, J. A. G., van Kessel, K. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Staphylococcal+Anti-Inflammatory+Protein+That+Antagonizes+the+Formyl+Peptide+Receptor-Like+1.">A New Staphylococcal Anti-Inflammatory Protein That Antagonizes the Formyl Peptide Receptor-Like 1.</a> The Journal of Immunology. 177, 8017-8026 (2006).</li><li>de Haas, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+inhibitory+protein+of+Staphylococcus+aureus,+a+bacterial+antiinflammatory+agent.">Chemotaxis inhibitory protein of Staphylococcus aureus, a bacterial antiinflammatory agent.</a> The Journal of Experimental Medicine. 199, 687-695 (2004).</li><li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+Staphylococcal+Phenol+Soluble+Modulins+by+Serum+Lipoprotein+Particles.">Inactivation of Staphylococcal Phenol Soluble Modulins by Serum Lipoprotein Particles.</a> PLoS Pathog. 8, e1002606 (2012).</li><li>Kubica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Potential+New+Pathway+for+Staphylococcus+aureus+Dissemination:+The+Silent+Survival+of+S.+aureus+Phagocytosed+by+Human+Monocyte-Derived+Macrophages.">A Potential New Pathway for Staphylococcus aureus Dissemination: The Silent Survival of S. aureus Phagocytosed by Human Monocyte-Derived Macrophages.</a> PLoS ONE. 3, e1409 (2008).</li><li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+alpha-phenol+soluble+modulins+contribute+to+neutrophil+lysis+after+phagocytosis.">Staphylococcal alpha-phenol soluble modulins contribute to neutrophil lysis after phagocytosis.</a> Cellular Microbiology. , (2013).</li><li>Queck, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAIII-Independent+Target+Gene+Control+by+the+agr+Quorum-Sensing+System:+Insight+into+the+Evolution+of+Virulence+Regulation+in+Staphylococcus+aureus.">RNAIII-Independent Target Gene Control by the agr Quorum-Sensing System: Insight into the Evolution of Virulence Regulation in Staphylococcus aureus.</a> Molecular Cell. 32, 150 (2008).</li><li>Baban, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+Bacterial+Imaging+In+Vivo.">Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo.</a> J. Vis. Exp. (69), e4318 (2012).</li></ol>

В способах, описанных здесь некоторых шаги очень критическим. Мы будем выделить эти здесь. Для изоляции нейтрофилах центрифугированием в градиенте плотности оно имеет важное значение, чтобы не потревожить слои, во время или после того, как центрифугирование шагов. Когд?...

Нейтрофилы (PMNs) профессиональные фагоциты, которые играют ключевую роль в врожденную иммунную ответ против золотистый стафилококк 1. Постоянном битве между хоста и микроба привела к гонки вооружений того и другого. В последнее время сообществу-связанного (CA) штаммов Meticillin устойчивыми штаммами S. стафилококк (MRSA) появились, которые, кажется, очень эффективным в обход Совета нейтрофилом убийству 2,3. Чрезмерные фенолом растворимые модулин (PSMs) производство CA-MRSA была связана с более высокими вирулентности 4,5. Человека нейтрофилах могут распознать эти PSMs через FPR2, которые приводят к активация этого G-белком рецептор 6. Один из самых ранних событий является мобилизацией внутриклеточного МАГАЗИНЫ кальция (Ca 2 +). Са 2 + выступает в качестве вторичного посланник для разнообразие эффекторных функций из PMNs в том числе дегрануляции и фагоцитоз 7. Поэтому Ca 2 + является очень чувствительным индикаторомфункциональную способность PSMs, чтобы активировать PMNs. Для изучения эффекты из PSMs на нейтрофилах, свежий нейтрофилы изолированы и загружается с краситель, который флуоресцирует на мобилизации кальция. В эксперименте по проточную цитометрию эту быстрой мобилизации может быть измерена. Используя этот метод, оно является возможным изучать прямые эффекты из токсичные и с другими компонентами на нейтрофилы, и определить самую низкую концентрация, при которой эти являются активными. Для нас это является очень полезный инструмент, чтобы изучения влияния многих белки, продуцируемые S. стафилококк, участвующих в иммунном уклонением, такие, как FPR2 ингибиторного белка (FLIPR) 8, FLIPR-подобный +7, и Хемотаксис ингибиторного белка из золотистый стафилококк (CHIPS) 9. Все эти белки, были показанный, чтобы ингибировать кальций мобилизация в нейтрофилах путем связывания с рецептор признавая агонистом. В последнее время наша группа описано, что PSMs являются функционально ингибируются сывороточные липопротеины +10 &lt;/ Вир&gt;. Эти липопротеины в большом количестве присутствуют в пределах в кровь и человеческой ткани, указывая, что PSMs оказывают свое функция в первую очередь в внутриклеточный окружающую среду. Доступность из анализе мобилизацию кальция позволила нам точно измерить эффект из сывороточные липопротеины на активации нейтрофилах по PSMs, на что указывает значительный ингибирование с помощью очень низких концентрациях из сыворотке крови. Так как PSMs являются функционально ингибируется при добавлении сыворотки к мы предположили, что там является важной функцией для PSMs как внутриклеточные токсинов. Поэтому мы стремились, чтобы определить роли PSMs после того, как фагоцитоза. Чтобы исследовать выражением PSMs в межклеточном пространстве, мы построили репортером слияний от промотора из psmα оперон, чтобы GFP. Когда эти репортером штаммы S. стафилококк были фагоцитированы нейтрофилах, индукция выражения мнения было наблюдаемыми с помощью флуоресцентной микроскопии +10. Очевидно, что эта TEChnique позволяет изучением выражение из большого числа из гены в S. стафилококк или других патогенами после того, как фагоцитоза. Так как для S. стафилококк выживших в межклеточном нишу очень важна, чтобы преодолеть врожденная иммунная система 11 10 12, изучая роли генов активированы в этой нише является высоко, важной для понимания его вирулентность.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-3, AM</td>
			<td>Molecular Probes / Life Technologies</td>
			<td>F-1241</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5442-03</td>
			<td>density 1.077 g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11191</td>
			<td>density 1.119 g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>52400-025</td>
			<td>contains 25 mM HEPES and L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, The Netherlands</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td>objective: HCX PL APO 40X/0.85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>Very important that the tube can be removed and replaced during the measurement process</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying interactions of staphylococcus aureus with neutrophils by flow cytometry and time lapse microscopy

Мы представляем методы для изучения влияния фенола растворимые модулинов (PSMs) и другие токсины, вырабатываемые и выделяемые золотистый стафилококк на нейтрофилы. Для изучения влияния PSMs на нейтрофилы мы изолируем свежих нейтрофилов использованием центрифугирования в градиенте плотности. Эти нейтрофилы загружаются с красителем, который флуоресцирует при мобилизации кальция. Активацию нейтрофилов PSMs инициирует быстрое и кратковременное повышение в свободном внутриклеточной концентрации кальция. В эксперименте проточной цитометрии этой быстрой мобилизации может быть измерена путем мониторинга флуоресценции предварительно загруженных краситель, который реагирует на повышение концентрации свободного Ca2 +. С помощью этого метода можно определить PSM концентрации, необходимой для активации нейтрофилов и измерить эффекты конкретные и общие ингибиторы активации нейтрофилов. Чтобы исследовать экспрессию PSMs в межклеточном пространстве, шэлектронной построили репортер слитых от промотора из PSMα оперон, чтобы GFP. Когда эти репортером штаммы S. стафилококк фагоцитированы нейтрофилах, индукция выражение может быть, наблюдаемые с помощью флуоресцентной микроскопии.

Проточной цитометрии анализе для оценки мобилизации кальция в человеческих PMNs Инкубирующие нейтрофилах с концентрацией серия из синтетический PSMα3 что приводит к быстрому активация как измерено кальций флюс, которая показана по увеличение в сигнале в FL-1. Предварительно...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy at JoVE.com

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy (Video) | JoVE

Мы представляем методы для изучения эффект PSMs и других токсинов выделяемый<em&gt; Золотистый стафилококк</em&gt; На нейтрофилах использованием проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии.

Изучение взаимодействий<em&gt; Золотистый стафилококк</em&gt; С нейтрофилами с помощью проточной цитометрии и микроскопии Длительная

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis (Video) | JoVE

Использование потоков для слива воды и вращающихся дисков для реакторов Золотистый стафилококк Биопленка Анализ

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA (Video) | JoVE

Подкожный Заражение метициллину Staphylococcus Aureus устойчивы (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source (Video) | JoVE

Золотистый стафилококк рост использования человеческого гемоглобина в качестве источника железа

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry (Video) | JoVE

Простой и эффективный метод для обнаружения ядерных активация фактора в человеческих нейтрофилов с помощью проточной цитометрии

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry (Video) | JoVE

Обнаружение Люминесцентные наночастиц Взаимодействие с первичного иммунного субпопуляциях Сотовые помощью проточной цитометрии

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time (Video) | JoVE

Воображение нейтрофилов и моноцитов в брыжеечных вен Прижизненное микроскопии на наркотизированных мышей в реальном времени

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR (Video) | JoVE

генотипирование<em&gt; Стафилококк</em&gt; рибосомальным Spacer ПЦР (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus (Video) | JoVE

Методика изучения горизонтальных генного переноса в<em&gt; Стафилококк</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages (Video) | JoVE

Изоляции и в пробирке культуры мышиных и человека альвеолярные макрофаги

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages (Video) | JoVE

Промежуток времени 3D визуализации фагоцитоза макрофагами, мыши

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...