Name: studying interactions of staphylococcus aureus with neutrophils by flow cytometry and time lapse microscopy
Uploaded: 2013-07-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy at JoVE.com

<p class="jove_content"&gt; RN fue parcialmente financiado por una Marie Curie Becas Re-integración europeas (ERG) del Séptimo Programa Marco de la Comunidad Europea, el número de proyecto 268324.</p&gt;

1. Aislamiento de PMN de sangre humana mediante centrifugación de densidad <ol><li> Dibuja 5 9 tubos ml de sangre venosa heparinizada. </li><li> Preparar de doble capa de gradientes de Ficoll (4 gradientes para 5 tubos de sangre) de la siguiente manera: Verter 12 ml de una densidad de 1,119 g / ml de solución de Ficoll en un tubo de 50 ml y cuidadosamente capa de 10 ml de una densidad de 1,077 g / ml de solución de Ficoll en la parte superior. </li><li> Diluir la sangre con un volumen igual de PBS. </li><li> Capa d...

<ol>
	<li>Rigby, K. M., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+innate+host+defense+against+Staphylococcus+aureus+infections.">Neutrophils in innate host defense against Staphylococcus aureus infections.</a> Semin. Immunopathol. 34, 237-259 (2012).</li><li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+Mechanisms+Used+by+Staphylococcus+aureus+to+Avoid+Destruction+by+Human+Neutrophils.">Insights into Mechanisms Used by Staphylococcus aureus to Avoid Destruction by Human Neutrophils.</a> The Journal of Immunology. 175, 3907-3919 (2005).</li><li>Kobayashi, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+neutrophil+destruction+following+phagocytosis+of+Staphylococcus+aureus.">Rapid neutrophil destruction following phagocytosis of Staphylococcus aureus.</a> J. Innate Immun. 2, 560-575 (2010).</li><li>DeLeo, F. R., Otto, M., Kreiswirth, B. N., Chambers, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community-associated+meticillin-resistant+Staphylococcus+aureus.">Community-associated meticillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> The Lancet. 375, 1557 (2010).</li><li>David, M. Z., Daum, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community-Associated+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus:+Epidemiology+and+Clinical+Consequences+of+an+Emerging+Epidemic.">Community-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: Epidemiology and Clinical Consequences of an Emerging Epidemic.</a> Clinical Microbiology Reviews. 23, 616-687 (2010).</li><li>Kretschmer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Formyl+Peptide+Receptor+2+Senses+Highly+Pathogenic+Staphylococcus+aureus.">Human Formyl Peptide Receptor 2 Senses Highly Pathogenic Staphylococcus aureus.</a> Cell Host &amp; Microbe. 7, 463 (2010).</li><li>Prat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+homolog+of+formyl+peptide+receptor-like+1+(FPRL1)+inhibitor+from+Staphylococcus+aureus+(FPRL1+inhibitory+protein)+that+inhibits+FPRL1+and+FPR.">A homolog of formyl peptide receptor-like 1 (FPRL1) inhibitor from Staphylococcus aureus (FPRL1 inhibitory protein) that inhibits FPRL1 and FPR.</a> J. Immunol. 183, 6569-6578 (2009).</li><li>Prat, C., Bestebroer, J., de Haas, C. J. C., van Strijp, J. A. G., van Kessel, K. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Staphylococcal+Anti-Inflammatory+Protein+That+Antagonizes+the+Formyl+Peptide+Receptor-Like+1.">A New Staphylococcal Anti-Inflammatory Protein That Antagonizes the Formyl Peptide Receptor-Like 1.</a> The Journal of Immunology. 177, 8017-8026 (2006).</li><li>de Haas, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+inhibitory+protein+of+Staphylococcus+aureus,+a+bacterial+antiinflammatory+agent.">Chemotaxis inhibitory protein of Staphylococcus aureus, a bacterial antiinflammatory agent.</a> The Journal of Experimental Medicine. 199, 687-695 (2004).</li><li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+Staphylococcal+Phenol+Soluble+Modulins+by+Serum+Lipoprotein+Particles.">Inactivation of Staphylococcal Phenol Soluble Modulins by Serum Lipoprotein Particles.</a> PLoS Pathog. 8, e1002606 (2012).</li><li>Kubica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Potential+New+Pathway+for+Staphylococcus+aureus+Dissemination:+The+Silent+Survival+of+S.+aureus+Phagocytosed+by+Human+Monocyte-Derived+Macrophages.">A Potential New Pathway for Staphylococcus aureus Dissemination: The Silent Survival of S. aureus Phagocytosed by Human Monocyte-Derived Macrophages.</a> PLoS ONE. 3, e1409 (2008).</li><li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+alpha-phenol+soluble+modulins+contribute+to+neutrophil+lysis+after+phagocytosis.">Staphylococcal alpha-phenol soluble modulins contribute to neutrophil lysis after phagocytosis.</a> Cellular Microbiology. , (2013).</li><li>Queck, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAIII-Independent+Target+Gene+Control+by+the+agr+Quorum-Sensing+System:+Insight+into+the+Evolution+of+Virulence+Regulation+in+Staphylococcus+aureus.">RNAIII-Independent Target Gene Control by the agr Quorum-Sensing System: Insight into the Evolution of Virulence Regulation in Staphylococcus aureus.</a> Molecular Cell. 32, 150 (2008).</li><li>Baban, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+Bacterial+Imaging+In+Vivo.">Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo.</a> J. Vis. Exp. (69), e4318 (2012).</li></ol>

En los métodos descritos aquí algunos pasos son muy críticos. Vamos a destacar estas aquí. Para el aislamiento de neutrófilos por centrifugación en gradiente de densidad es importante no perturbar las capas durante o después de las etapas de centrifugación. Al aspirar los neutrófilos utilizando una pipeta de plástico, asegúrese de no apretar el globo, mientras que en la capa de células, como inyectar líquido perturbará las capas. Además, inspeccione visualmente el sedimento de...

Los neutrófilos (PMNs) son fagocitos profesionales que juegan un papel clave en la respuesta inmune innata contra Staphylococcus aureus 1. La batalla constante entre el huésped y microbio ha llevado a una carrera de armamentos de ambos. Recientemente, cepas relacionadas con la comunidad (CA) de la meticilina resistente S. aureus (MRSA) se han comprobado que parece ser muy eficiente en la elusión de los neutrófilos muerte 2,3. Modulina (MEP) soluble en fenol producción excesiva de CA-MRSA se ha asociado con una mayor virulencia 4,5. Los neutrófilos humanos pueden reconocer estos MEP a través de FPR2 que conducen a la activación de esta proteína G-receptor acoplado a 6. Uno de los acontecimientos más tempranos es la movilización de las reservas intracelulares de calcio (Ca2 +). Ca 2 + actúa como un segundo mensajero para una variedad de funciones efectoras de los PMN incluyendo la desgranulación y la fagocitosis 7. Por lo tanto Ca 2 + es un indicador muy sensible de lacapacidad funcional de las MEP para activar PMNs. Para estudiar los efectos de las MEP sobre los neutrófilos, los neutrófilos frescas se aíslan y se cargan con un medio de contraste que emite fluorescencia en la movilización del calcio. En un experimento de citometría de flujo de esta rápida movilización se puede medir. El uso de este método, es posible estudiar los efectos directos de los componentes tóxicos y otro sobre los neutrófilos, y determinar la concentración más baja a la que éstos están activos. Para nosotros, es una herramienta muy útil para estudiar el efecto de muchas proteínas producidas por S. aureus implicado en la evasión inmune, como FPR2 proteína inhibidora (FLIPR) 8, FLIPR-like 7 y quimiotaxis proteína inhibidora de Staphylococcus aureus (CHIPS) 9. Todas estas proteínas se ha demostrado que inhiben la movilización de calcio en los neutrófilos por la unión al receptor que reconoce el agonista. Recientemente, nuestro grupo ha descrito que las MEP son funcionalmente inhibidos por las lipoproteínas séricas de 10 &lt;/ Sup&gt;. Estas lipoproteínas son abundantemente presente dentro de la sangre y el tejido humano, lo que indica que las MEP ejercen su función principalmente en el medio ambiente intracelular. La disponibilidad del ensayo de movilización de calcio nos permitió medir precisamente el efecto de las lipoproteínas séricas en la activación de neutrófilos por los MEP, indicado por la considerable inhibición por concentraciones muy bajas de suero. Dado que los MEP están funcionalmente inhibidos por el suero, la hipótesis de que hay una función importante para las MEP como las toxinas intracelulares. Por lo tanto, trató de determinar el papel de las MEP después de la fagocitosis. Para investigar la expresión de los PSM en el espacio intercelular, hemos construido fusiones reportero del promotor del operón psmα a GFP. Cuando estos reportero cepas de S. aureus fueron fagocitadas por los neutrófilos, la inducción de la expresión se observa mediante microscopía de fluorescencia 10. Obviamente, esta technique permite el estudio de la expresión de un gran número de genes en S. aureus u otros patógenos después de la fagocitosis. Dado que para S. aureus sobrevivir en el nicho intercelular es muy importante para superar el sistema inmune innato 11 10 12, el estudio del papel de los genes activados en este nicho es altamente relevante para la comprensión de su virulencia.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-3, AM</td>
			<td>Molecular Probes / Life Technologies</td>
			<td>F-1241</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5442-03</td>
			<td>density 1.077 g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11191</td>
			<td>density 1.119 g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>52400-025</td>
			<td>contains 25 mM HEPES and L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, The Netherlands</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td>objective: HCX PL APO 40X/0.85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>Very important that the tube can be removed and replaced during the measurement process</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying interactions of staphylococcus aureus with neutrophils by flow cytometry and time lapse microscopy

Se presentan métodos para estudiar el efecto de modulinas solubles en fenol (PSM) y otras toxinas producidas y secretadas por Staphylococcus aureus en los neutrófilos. Para estudiar los efectos de los PSM en los neutrófilos que aislamos neutrófilos frescos utilizando centrifugación en gradiente de densidad. Estos neutrófilos se cargan con un medio de contraste que emite fluorescencia en la movilización del calcio. La activación de los neutrófilos por las MEP inicia un aumento rápido y transitorio en la concentración de calcio libre intracelular. En un experimento de citometría de flujo de esta rápida movilización se puede medir mediante el control de la fluorescencia de un colorante pre-cargado que reacciona con el aumento de la concentración de Ca2 + libre. Con este método se puede determinar la concentración PSM necesario activar los neutrófilos, y medir los efectos de los inhibidores específicos y generales de la activación de los neutrófilos. Para investigar la expresión de los PSM en el espacio intracelular, we han construido fusiones reportero del promotor del operón PSMα a GFP. Cuando estos reportero cepas de S. aureus son fagocitadas por los neutrófilos, la inducción de la expresión se puede observar mediante microscopía de fluorescencia.

Ensayo de citometría de flujo para la evaluación de la movilización de calcio en los PMN humanos La incubación de los neutrófilos con una serie de concentración de PSMα3 sintéticos resultantes en la activación rápida tal como se mide por el flujo de calcio, que se muestra por un aumento en la señal en FL-1. Pre-incubación de PSMα3 sintético con 0,01%, 0,1% o 1% de suero humano inhibió significativamente la capacidad para obtener los flujos de calcio (Figura 1). <...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy at JoVE.com

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Se presentan métodos para estudiar el efecto de las MEP y otras toxinas secretadas por<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; En los neutrófilos usando citometría de flujo y microscopía de fluorescencia.

El estudio de las interacciones de<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Con neutrófilos mediante citometría de flujo y microscopía Tiempo Lapso

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

El uso de un flujo de goteo y la rotación del disco para reactores Staphylococcus aureus Análisis de Biofilm

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

Investigación

Inmunología e Infección

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA

Subcutánea infección de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Crecimiento con hemoglobina humana como una fuente de hierro

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Un método simple y eficiente para detectar la activación del factor nuclear en neutrófilos humanos por citometría de flujo

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

La detección de nanopartículas fluorescentes Interacciones con inmunodeficiencia primaria subpoblaciones celulares por citometría de flujo

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Imaging neutrófilos y monocitos en mesentérica venas por Microscopia intravital en ratones anestesiados en Tiempo Real

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

genotipado de<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; por Ribosómica espaciador de PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

Metodología para el Estudio de la transferencia horizontal de genes en<em&gt; Staphylococcus aureus</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Aislamiento y cultivo In Vitro de los macrófagos alveolares murinos y humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Proyección de imagen 3D Time-lapse de la fagocitosis por macrófagos de ratón

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...