Name: studying interactions of staphylococcus aureus with neutrophils by flow cytometry and time lapse microscopy
Uploaded: 2013-07-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy at JoVE.com

<p class="jove_content"&gt; RN har delvis finansierats av ett Marie Curie europeisk återintegrering Grants (ERG) från Europeiska gemenskapens sjunde ramprogram, projektnummer 268.324.</p&gt;

Ett. Isolering av PMNs från humant blod genom densitetscentrifugering <ol><li> Rita 5 9 ml rör av hepariniserat venöst blod. </li><li> Förbered dubbla lager Ficoll-gradienter (4 gradienter för fem tuber blod) enligt följande: Häll 12 ml av en densitet 1,119 g / ml ficoll lösning i ett 50 ml rör och försiktigt skiktet 10 ml av en densitet 1,077 g / ml ficoll lösningen på toppen. </li><li> Späd blod med en lika stor volym PBS. </li><li> Layer det utspädda blodet försiktigt på dubbla lager Ficoll gradient...

<ol>
	<li>Rigby, K. M., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+innate+host+defense+against+Staphylococcus+aureus+infections.">Neutrophils in innate host defense against Staphylococcus aureus infections.</a> Semin. Immunopathol. 34, 237-259 (2012).</li><li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+Mechanisms+Used+by+Staphylococcus+aureus+to+Avoid+Destruction+by+Human+Neutrophils.">Insights into Mechanisms Used by Staphylococcus aureus to Avoid Destruction by Human Neutrophils.</a> The Journal of Immunology. 175, 3907-3919 (2005).</li><li>Kobayashi, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+neutrophil+destruction+following+phagocytosis+of+Staphylococcus+aureus.">Rapid neutrophil destruction following phagocytosis of Staphylococcus aureus.</a> J. Innate Immun. 2, 560-575 (2010).</li><li>DeLeo, F. R., Otto, M., Kreiswirth, B. N., Chambers, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community-associated+meticillin-resistant+Staphylococcus+aureus.">Community-associated meticillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> The Lancet. 375, 1557 (2010).</li><li>David, M. Z., Daum, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community-Associated+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus:+Epidemiology+and+Clinical+Consequences+of+an+Emerging+Epidemic.">Community-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: Epidemiology and Clinical Consequences of an Emerging Epidemic.</a> Clinical Microbiology Reviews. 23, 616-687 (2010).</li><li>Kretschmer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Formyl+Peptide+Receptor+2+Senses+Highly+Pathogenic+Staphylococcus+aureus.">Human Formyl Peptide Receptor 2 Senses Highly Pathogenic Staphylococcus aureus.</a> Cell Host &amp; Microbe. 7, 463 (2010).</li><li>Prat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+homolog+of+formyl+peptide+receptor-like+1+(FPRL1)+inhibitor+from+Staphylococcus+aureus+(FPRL1+inhibitory+protein)+that+inhibits+FPRL1+and+FPR.">A homolog of formyl peptide receptor-like 1 (FPRL1) inhibitor from Staphylococcus aureus (FPRL1 inhibitory protein) that inhibits FPRL1 and FPR.</a> J. Immunol. 183, 6569-6578 (2009).</li><li>Prat, C., Bestebroer, J., de Haas, C. J. C., van Strijp, J. A. G., van Kessel, K. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Staphylococcal+Anti-Inflammatory+Protein+That+Antagonizes+the+Formyl+Peptide+Receptor-Like+1.">A New Staphylococcal Anti-Inflammatory Protein That Antagonizes the Formyl Peptide Receptor-Like 1.</a> The Journal of Immunology. 177, 8017-8026 (2006).</li><li>de Haas, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+inhibitory+protein+of+Staphylococcus+aureus,+a+bacterial+antiinflammatory+agent.">Chemotaxis inhibitory protein of Staphylococcus aureus, a bacterial antiinflammatory agent.</a> The Journal of Experimental Medicine. 199, 687-695 (2004).</li><li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+Staphylococcal+Phenol+Soluble+Modulins+by+Serum+Lipoprotein+Particles.">Inactivation of Staphylococcal Phenol Soluble Modulins by Serum Lipoprotein Particles.</a> PLoS Pathog. 8, e1002606 (2012).</li><li>Kubica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Potential+New+Pathway+for+Staphylococcus+aureus+Dissemination:+The+Silent+Survival+of+S.+aureus+Phagocytosed+by+Human+Monocyte-Derived+Macrophages.">A Potential New Pathway for Staphylococcus aureus Dissemination: The Silent Survival of S. aureus Phagocytosed by Human Monocyte-Derived Macrophages.</a> PLoS ONE. 3, e1409 (2008).</li><li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+alpha-phenol+soluble+modulins+contribute+to+neutrophil+lysis+after+phagocytosis.">Staphylococcal alpha-phenol soluble modulins contribute to neutrophil lysis after phagocytosis.</a> Cellular Microbiology. , (2013).</li><li>Queck, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAIII-Independent+Target+Gene+Control+by+the+agr+Quorum-Sensing+System:+Insight+into+the+Evolution+of+Virulence+Regulation+in+Staphylococcus+aureus.">RNAIII-Independent Target Gene Control by the agr Quorum-Sensing System: Insight into the Evolution of Virulence Regulation in Staphylococcus aureus.</a> Molecular Cell. 32, 150 (2008).</li><li>Baban, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+Bacterial+Imaging+In+Vivo.">Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo.</a> J. Vis. Exp. (69), e4318 (2012).</li></ol>

I de metoder som beskrivs här några steg är mycket kritisk. Vi kommer att belysa dessa här. För isolering av neutrofiler genom densitetsgradientcentrifugering är det viktigt att inte störa skikten under eller efter centrifugeringssteg. När aspirera neutrofiler med hjälp av en plast pipett, se till att inte pressa ballongen medan i lager av celler, kommer så mata vätska stör skikten. Också, visuellt inspektera pelleten av neutrofiler efter osmotisk chock och centrifugeringssteg. ...

Neutrofiler (PMNs) är professionella fagocyter som spelar en nyckelroll i den innate immunsvar mot Staphylococcus aureus 1. Den ständig kamp mellan värd och mikrob har lett till en kapprustning av båda. Som nyligen fått, community-associerade (CA) stammar av meticillin resistenta S. aureus (MRSA) har framkommit att verkar vara mycket effektiva i kringgående av neutrofil dödande 2,3. Överdriven fenol lösligt modulin (PSM) produktion av CA-MRSA har associerats med högre virulens 4,5. Humana neutrofiler kan känna igen dessa PSM via FPR2 som leder till aktivering av denna G-kopplad receptor för sex. En av de tidigaste händelserna är den mobilisering av intracellulära butiker av kalcium (Ca 2 +). Ca 2 + fungerar som en sekundär budbärare för en mängd olika effektorfunktionerna hos PMN: er inklusive degranulering och fagocytos syv. Därför Ca två + är en mycket känslig indikator på denfunktionell kapacitet av PSM för att aktivera PMN: er. För att studera effekterna av PSM på neutrofiler, är färska neutrofiler isoleras och laddad med ett färgämne som fluorescerar upon calcium mobilisering. I en flödescytometri experiment denna snabba mobilisering kan mätas. Använda denna metod, är det möjligt att studera de direkta effekterna av toxiska-och andra komponenter på neutrofiler, och bestämma den lägsta koncentration vid vilken dessa är aktiva. För oss, är det ett mycket användbart verktyg för att studera effekten av många proteiner producerade av S. aureus involverad i immun skatteflykt, såsom FPR2 inhiberande protein (FLIPR) 8, FLIPR-liknande 7, och Chemotaxis inhiberande protein av Staphylococcus aureus (CHIPS) 9. Alla dessa proteiner har visat sig inhibera kalciummobilisering i neutrofiler genom att binda till receptorn erkänna agonisten. Nyligen, har vår grupp beskriven att PSM funktionellt är inhiberas av serumlipoproteiner 10 &lt;/ Sup&gt;. Dessa lipoproteiner är högst närvarande i blodet och mänsklig vävnad, vilket indikerar att PSM utövar sin funktion främst i den intracellulära miljön. Tillgängligheten av kalciummobiliseringen analysen tillät oss att exakt mäta effekten av serumlipoproteiner på aktivering av neutrofiler av PSM, indikeras av den betydande hämning av mycket låga koncentrationer av serum. Eftersom PSM är funktionellt hämmas av serum, hypotes vi att det är en viktig funktion för PSM som intracellulära toxiner. Vi försökte därför att bestämma rollen av PSM efter fagocytos. För att undersöka uttrycket av PSM i det intercellulära utrymmet, har vi konstruerat reporter fusioner av promotorn för psmα operonet till GFP. När dessa reporter stammar av S. aureus var fagocyteras av neutrofiler, var induktion av expression observeras med fluorescens mikroskopi 10. Uppenbarligen denna technique tillåter studiet av expression av ett stort antal gener i S. aureus eller andra patogener efter fagocytos. Eftersom för S. aureus överleva i intercellulära nisch är mycket viktigt att övervinna det medfödda immunförsvaret 11 10 12, studera rollen av gener aktiveras i denna nisch är mycket relevant för att förstå dess virulens.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-3, AM</td>
			<td>Molecular Probes / Life Technologies</td>
			<td>F-1241</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5442-03</td>
			<td>density 1.077 g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11191</td>
			<td>density 1.119 g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>52400-025</td>
			<td>contains 25 mM HEPES and L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, The Netherlands</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td>objective: HCX PL APO 40X/0.85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>Very important that the tube can be removed and replaced during the measurement process</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying interactions of staphylococcus aureus with neutrophils by flow cytometry and time lapse microscopy

Vi presenterar metoder för för att studera effekten av fenol lösliga modulins (PSM) och andra gifter som produceras och utsöndras av Staphylococcus aureus på neutrofiler. För att studera effekterna av de PSM om neutrofiler vi isolerar färska neutrofiler som använder centrifugering density gradient. Dessa neutrofiler är laddade med ett färgämne som fluorescerar upon calcium mobilisering. Den aktiveringen av neutrofiler genom PSM initierar en snabb och övergående ökning av den fria intracellulära kalcium koncentration. I ett flödescytometri experiment denna snabb mobilisering kan mätas genom övervakning av fluorescensen av en förladdad färgämne som reagerar på den ökade koncentrationen av fri Ca 2 +. Använda denna metod vi kan bestämma den PSM koncentration som är nödvändig för att aktivera neutrofila, och mäta effekterna av specifika och allmänna inhibitorer av den neutrofil aktiveringen. För att undersöka uttrycket av de PSM i den intracellulära utrymmet, we har konstruerat reporter fusioner av den promotorn av den PSMα operonet till GFP. När dessa reporter stammar av S. aureus är fagocyteras genom neutrophils, kan den induktion av expression observeras användning av fluorescens mikroskopi.

Flödescytometrisk analys för bedömning av kalciummobilisering i humana PMN Inkubation neutrofiler med en koncentration rad syntetiska PSMα3 resulterar i snabb aktivering mätt genom kalciumflöde, som visas genom en ökning i signalen i FL-1. Förinkubation av syntetiskt PSMα3 med 0,01%, inhiberad 0,1% eller 1% humant serum avsevärt förmågan att framkalla kalcium flussmedel (Figur 1). Analys av GFP uttryck i bakterier efter fagocytos av PMN med...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy at JoVE.com

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Vi presenterar metoder för att studera effekten av PSM och andra gifter som utsöndras av<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; På neutrofiler med hjälp av flödescytometri och fluorescensmikroskopi.

Studera Interaktioner av<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Med Neutrofiler genom flödescytometri-och Time Lapse Mikroskopi

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Användning av Drip Flow och roterande reaktorer Disk för Staphylococcus aureus Biofilm Analys

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA

Subkutan Infektion med meticillinresistenta Staphylococcus aureus (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Tillväxt med humant hemoglobin som järnkälla

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

En enkel och effektiv metod för att upptäcka Nuclear Factor Aktivering av humana neutrofiler genom flödescytometri

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Upptäckt av fluorescerande nanopartiklar Interaktion med Primär Immun cellsubpopulationer med flödescytometri

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Imaging Neutrofiler och Monocyter i Mesenteric Veins av Intravital Mikroskopi på sövda möss i realtid

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

genotypning av<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; vid Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

Metodik för studier av horisontell genöverföring i<em&gt; Staphylococcus aureus</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolering och In Vitro kultur av murina och mänskliga alveolära makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Time-lapse 3D Imaging av fagocytos av mus makrofager

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...