Name: isolation, culture, and imaging of human fetal pancreatic cell clusters
Uploaded: 2014-05-18T19:45:00
Duration: 8 min 9 s
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この作品は、再生医療のためのカリフォルニア工科大学（RB3-02266）およびNIH（DK54441）によってサポートされていました。

始める前に必ず注意事項： <ol><li>ヒト胎児の膵臓は、先天異常研究所、組織を採取し、ワシントン大学（シアトル、ワシントン州、米国）から入手した。試料の組織寄付、保管、および使用のためのインフォームドコンセントを中心によってドナーから得た。プロトコルの同意文が書面で提供され、カリフォルニア大学サンディ​​エゴ校ヒューマン研究プロテクションプログラム全体の研究（プロトコール＃081237XT）に承認された。 </li><li>それは、ヒト胎児の膵臓全体手順の間、氷上で膵臓を保持する容器の両方を維持することが不可欠である。解離および消化は可能な限り高速に実行する必要があります。 </li><li>ヒト胎児膵臓は膵臓の貯蔵及び輸送のためにバッファから入手したクリニックを送信します。 （RPMI-1640 +10％正常ヒト血清（NHS）、300 mMのトレハロースSG、ペニシリン/ストレプトマイシン、およびファンギゾン）。 </li></ol>ヒト胎児膵臓の1。解剖<ol><li> 2.5 mg / mlの終濃度を得HBSSでRTコラゲナーゼXI 5mgを溶解する。 4℃での滅菌（オートクレーブ処理）シンチレーションバイアルおよびストアに0.22ミクロンのシリンジフィルターで溶液を濾過滅菌組織培養フードでは、2無菌ペトリ皿、無菌小さな坩堝（るつぼが使用できない場合、小さなビーカーを置換していてもよい）、滅菌ハサミとピンセットをセット。膵臓を洗浄するために1ペトリ皿に2ミリリットルのHBSSを追加します。約1ミリリットルを残して、胎児の膵臓を含むチューブから吸引液、。 </li><li> HBSSずに60ミリメートルペトリ皿にピンセットで膵臓を削除します。これらの実験のために、胎児のICCは、9から23週までの妊娠年齢との新鮮な膵臓から生成されます。以前gestionational年齢で膵臓からの単離は、膵臓の大きさに困難である。プロトコルは、Pのしかし買収、23週を超えて在胎期間に適用される可能性が高いancreataこの時間以降にあるため、連邦政府（米国）の制約のために困難である。時折、胎児の膵臓は脾臓、脂肪、または元の解剖から付属の結合組織で到着。余分な組織は、肉眼で容易に見えるとプロトコルを開始する前に、膵臓から除去されるべきである。 </li><li>シャーレ内の冷HBSS（〜0.5ミリリットル）の最小容量の膵臓を洗浄します。 </li><li>アイスバケットに滅​​菌ピンセットと場所を使用して、小さな無菌るつぼにきれいに膵臓を移動します。を50ml遠心管用のホルダーに坩堝を置き、はさみの2対を用いて、激しく数分間膵臓スライス。 （通常2〜5分間が、時間は、組織の大きさや硬さに依存します）。テクニックをカットすることが重要です。唯一の反対のハンドルを移動する固定位置にハサミの片側を保持する。ハサミの先端はるつぼの底にくるようにしてください。小さなに膵臓を破壊するために迅速なシザー運動を続行個。組織片が小さいほど、より良いコラゲナーゼは動作します。 </li><li>最大10分間、200rpmで37℃に設定したウォーターバスシェーカーでのコラゲナーゼと場所を含むバイアルにHBSS +切り刻ま膵臓の1.5ミリリットルを追加します。最初の5分の間に、より頻繁に何度もチェックしないでください。消化時間は、組織の品質に依存し、わずか6と分で十分である。粒子が小さく均一である場合、エンドポイントである。 </li><li>コラゲナーゼ活性を停止するために冷たいHBSSでバイアル（10〜15 ml）を入力します。氷の上に置き、塊が10分のために解決することができます。しばしば、この時点で、いくつかの細胞死が発生し、DNAを、培地中に放出される。これは、メディア &#39;糸&#39;することができます。この場合には、溶液（10 mg / mlのストック）を100μlのDNaseを追加。 </li><li>シンチレーションバイアル内の組織は、10分間のセトリングした最上層オフ吸引は（7〜8ミリリットル）半分よりわずかに小さく、それを出た後。 15ミリリットルコニカルチューブに細胞を移す、5ミリリットルのHBSSを追加。 300×gで5分間遠心分離します。 </li><li> HBSSを吸引し、RPMI-1640、グルタマックス、10％正常ヒト血清（NHS）、10のHEPES pHは7.2、ペニシリン/ストレプトマイシン、およびファンギゾンを含む5ミリリットル培地中の細胞を懸濁します。 60ミリメートルペトリ皿上のプレート。 β細胞を生成しようとしている研究者のため、メディアへのHGF（最終ミリリットル10 NGを/）を追加します。さらに、グループの数は、インクレチンホルモンGLP-1の培養培地を補充することも、β細胞28を増加させることを実証した。細胞はのICCを集約し、形成するために72時間、懸濁液中のままにしておきます。 </li><li> 29先に説明したように懸濁液中の72時間後、細胞はヒト細胞株HTB9マトリックスのマトリックス上に播種することができる。にかかわらず、成長条件の、メディアは48時間ごとに変更する必要があります。 </li></ol>浮遊培養のICCにおける内分泌細胞の増殖および成熟のマーカーの2。免疫蛍光、単層、あるいはガラスカバースリップ上<ol><li>細胞増殖を測定するために、懸濁液中の接着細胞または細胞のいずれかのBrdU標識の前PFA固定の12時間行われる。 BrdUの試薬は1:100 RPMI-1640中で滅菌フィルター、グルタマックス、10％のNHS、10mMのHEPES pH7.0の、ペニシリン/ストレプトマイシンおよびファンギゾンを希釈する。 </li><li> 懸濁液中の細胞の場合：300 XGと吸引培養液で5分間遠心分離する。 300 XGと吸引で5分間、遠心分離器をICCを洗うために10mlのPBSを追加します。のICCは、パラフィンに埋め込 ​​まれるようにしようとしている場合、オプションのプロトコル3.1から3.17に従ってください。 接着細胞の場合：培養液を取り出し、上記のようにPBSで細胞を洗浄。 PBSで2回洗った後、室温で4％PFAで20分間細胞を固定。この時点で、プレートをパラフィルムで包むことができ、1週間まで4℃でPBS中に保存した。 </li><li> RTで10分間PBS中の0.2％トリトンX-100で細胞をインキュベートする。 2％（ないPBSで2回細胞を洗浄し、ブロッキングバッファー適用NKEY血清、2％ウシ血清アルブミン、1時間、PBS）で希釈した50mMグリシン。 （バッファは1:10に希釈ブロックする）作業バッファで細胞を洗浄。作業バッファに抗体を希釈します。カバーガラス上で培養した細胞において、60μlの総容量で抗体を希釈する。 6ウェルディッシュ内の細胞のために、600μlの総容量で抗体を希釈する。複数のエピトープを染色するために、抗体のカクテルを適用してもよい。対照として、IgGのを使用するか、特定の抗体の代わりに免疫血清を事前。対照試料は、使用されている一次抗体と同じ種からの制御IgGと共にインキュベートしなければならない。 </li><li> 4℃で、室温またはO / Nで1.5時間のどちらか一次抗体をインキュベート一次抗体を吸引し、室温で作業バッファで3回洗う。 </li><li>アレクサ共役抗体について1:1,000 - ローダミンとFITC結合抗体について1:200、1:500で二次抗体を希釈します。これは、すべての二次抗体が軽い敏感であることに注意することが重要です。サンプルをカバーアルミホイルで信号の損失を防止する。室温で1時間インキュベートする。 オプション：核を可視化するために、DAPIは、二次インキュベーション中に1:500で添加することができる。これは全細胞集団におけるタンパク質発現の定量のために有用である。 </li><li>二次抗体を吸引し、室温で作業バッファで3回洗う。バッファに浸漬しながら、カバーガラス上で培養した細胞において、静かにピンセットでカバーグラスを持ち上げる。 PBSに浸漬することによって、それを洗う。 6ウェルプレートで増殖した細胞は、PBSで洗浄し、吸引するために追加します。この時点で、彼らは倒立顕微鏡下で検査する準備が整いました。 </li><li>過剰のPBSを取り除くためにキムワイプを軽くカバースリップの端をタッチします。スライドガラス上のマウントゲルのドロップを追加し、スライド上にカバースリップを反転する。吸引により過剰取り付けゲルを取り外します。気泡を除去するために200μlのピペットチップの裏で優しくカバースリップをタップします。 </li><li> 4℃で約20分間、又はO / Nで、室温での乾燥下で調べるとfluorescentまたは共焦点顕微鏡。 </li></ol>パラフィン包埋のICCからのタンパク質の3。（オプション）免疫蛍光染色<ol><li> 3％アガロース溶液を調製し、55〜60℃まで冷ます</li><li>室温で5分間、1,500×gでの15mlコニカルチューブに懸濁液中でインキュベートしたICC、遠心分離を転送する。 </li><li>細胞から培地を吸引除去し、室温で10分間、500μlの4％PFAで固定する。ペレットが非常に大きい場合を除き、ペレットを混ぜて使用しないでください。 </li><li> 750μlのPBSで2回ペレットを洗浄。 4％PFAと同様に、この廃棄物は、有害とみなされ、あなたの機関の有害廃棄物の仕様に従って廃棄しなければならない。 </li><li>静かに15ミリリットルコニカルチューブの壁の下のアガロースの150〜200μLを緩め、追加するために、細胞ペレットをフリック。 </li><li>優しくチューブをフリックで混ぜますが、気泡を形成しない。 </li><li> 5〜10分間、4℃で固化することができます。 </li><li>取り除くために、21 G針を使用して、新鮮な15ミリリットルコニカルチューブ内のペレットと場所。 </li><li>スライド上のパラフィン包埋切片の調製はミクロトームを使用してサイトにするか、コア顕微鏡施設で行うことができます。 </li><li>組織、水和物を脱パラフィンし、すぐに水で洗い流してください。 </li><li>残りのアルデヒドを急冷し、室温で30分間、0.2Mグリシンを追加します。 </li><li> 2分間ずつPBSで2回スライドを洗浄します。 </li><li>抗原回復のために、ホットプレート上で沸騰する10 mMのクエン酸緩衝液（6.0）を持参。それが戻って沸騰に来るのを待ち、15分間待機し、バッファ内のスライドを浸す。 </li><li>ホットプレートからビーカーを取り除きます。バッファに冷却するために、スライドは約40分待ちます。 </li><li> 1時間PBS中の2％正常ロバ血清でブロックし、5分間ずつPBSで2回スライドを洗浄、5分間ずつ、H 2 Oで二回スライドを洗浄します。 </li><li> 0.2％トリトンX-100を含むワーキングバッファー中適切な濃度に希釈した一次抗体と共にインキュベートする。ホルモン、増殖マーカー、および/または分化のために染色した場合の転写因子および1.5時間染色した場合、一般的に、一次抗体を一晩インキュベートする。 </li><li>上記のステップ2.3から2.9に従ってください。 </li></ol>

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D., Hayek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+hepatocyte+growth+factor/scatter+factor+to+increase+transplantable+human+fetal+islet+cell+mass.+Transplant.">Use of hepatocyte growth factor/scatter factor to increase transplantable human fetal islet cell mass. Transplant.</a> Proc. 26, 33-34 (1994).</li><li>Beattie, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+increase+human+islet+cell+mass+while+preserving+beta-cell+function.">A novel approach to increase human islet cell mass while preserving beta-cell function.</a> Diabetes. 51, 3435-3439 (2002).</li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

ここで紹介する方法は、ヒト胎児の膵臓からのICCを生成し、その後、細胞増殖および膵臓内胚葉のマーカーのイメージに1を有効にしてください。ヒト胎児膵臓解離のプロセスは、72時間ICCの形成期間、マウス由来β細胞前駆細胞を単離するプロトコールと実質的に異なるアプローチに続いて、約90分を要した。ここで紹介するプロトコルは、研究者は、ヒト胎児の膵臓の開発を探索することができ再現性のある方法を提供します。縦断的研究二つの異なるタイプを行うことができる。まず、異なる在胎齢から機能的膵細胞型（腺管細胞、外分泌細胞、およびホルモン陽性細胞）を生成する可能性は、移植後に評価することができる。第二に、単一の在胎齢からのICCは、選択された薬理学的薬剤で処理し、相違点を探索するICC培養中の異なる時点で移植し、培養で増殖させることができる細胞の運命にある。現在、インスリン産生細胞へのhESCの分化に向けられる多大な努力と、生理的刺激に応答してインスリン分泌に関連した問題を再度復活している。人間のICCは、胎児の膵臓の細胞増殖およびβ細胞開発のこの重要な側面を研究するユニークなモデル系を提供する。 組織から細胞を分離する任意のプロトコルと同様に、詳細が成功のために重要である。パラメータの数は、実験を行う実験者の制御外、残念ながらです。この研究室で発生した二つの問題は、貧しい人々の出発物質の質と非膵臓組織の送達を含む。健康な胎児の膵臓組織は、シザーカットする会社です。あまりにも簡単に組織をカットする場合は、膵臓の酵素が膵臓自体を消化し始めているという印である。このからのリカバリと準備最良のキャンセルされるが、残念ながらありません。まれに、中膵臓の除去、経験豊富な技術者が、膵臓のために腸の部分を混乱させます。これらのサンプルは、膵臓よりもはるかに弾性を有し、顕著なルーメンが存在するであろう。繰り返しますが、これらのサンプルは破棄されるべきである。 説明したように上記のプロトコルが続く場合、トラックからの分離をスローするように発生した問題はほとんどありません。円滑な分離を確保するために覚えておくべきいくつかのポイントは、正確な膵臓切断に鋭いハサミを使用するようにして消化するには大きすぎる任意の組織サンプルを残さないようにすることを確認し、含まれています。カットが十分に小さくない場合、コラゲナーゼを効果的に機能せず、いくつかのICCが形成されている。コラゲナーゼの新しいバッチを使用する際に消化のためIU（国際単位）は、以前に使用される場合には逆に、同じようなレベルで始まる。しかし、オーバー消化が生じないことを保証するためにインキュベーション時間を減少させる。このトラブルシューティング技法は、IUラベルがバッチからBAに大きく変化しないことが保証さTCH。 視点で撮影され、ヒト胎児のICCを単離するためのこの手法は、フィールドでは比較的標準です。ほとんどの研究室は、メディアへのHGFの添加は、細胞が33を生き残り、増殖するのに役立ちますことを我々の調査結果を確認した。要約すると、我々は9〜23週までの妊娠の年齢で、ヒト胎児のICC新鮮な膵臓を単離するための方法を開発した。細胞は、単層として又は膵臓内分泌転写因子およびヒトインスリンを視覚化する実験のための懸濁液中で増殖することができる。

1型糖尿病における細胞ベースのインスリン補充療法への主な制約は、移植のためのヒト膵島の不足である。インスリン欠乏状態の代謝要求を満たすインスリン産生細胞へのヒト膵臓前駆細胞の増殖および分化を調節する能力は、1型糖尿病を治療するための細胞ベースの治療のための重要なビルディングブロックのままである。 ヒトES細胞由来のインスリン産生細胞の出現までは、ヒト胎児の膵臓の内分泌細胞またはその前駆体は、臨床移植のための細胞の潜在的な源として見られていた。科学的、規制環境は、ここ数年の間に変更されましたが、ヒト胎児の膵臓の発達を理解するための重要な必要性が残っている。多くは現在、細胞を拡大するための効果的かつ安全な方法が確立された場合には低いが、これらの細胞の治療的使用可能性は、Ag、ヒト胎児細胞の治療的使用を視聴AINが検討される。そのヒト胎児膵臓細胞凝集塊（のICC）の試験管内変換におけるグルコース応答インスリン分泌内分泌細胞にあるまま大きなハードルは、現在、非効率的なプロセスである。多くの作業が終わっほぼ30年間解明および内分泌膵臓の発達に必要な転写因子の発現プロファイルを描写しているが、ギャップは、転写因子の時間的な発現が調節され、細胞機能に関連する方法に関する我々の知識に残っている。 ヒトES細胞由来のインスリン産生細胞の出現までは、ヒト胎児の膵臓の内分泌細胞またはその前駆体は、臨床移植のための細胞の潜在的な源として見られていた。科学的、規制環境は、ここ数年の間に変更されましたが、ヒト胎児の膵臓の発達を理解するための重要な必要性が残っている。多くは現在、しかし、効果的な場合には、可能性は低いとしてのヒト胎児細胞の治療的使用を表示細胞を拡大するための安全な方法が確立されたと、これらの細胞の治療的使用を再度検討することができた。そのヒト胎児膵臓細胞凝集塊（のICC）の試験管内変換におけるグルコース応答インスリン分泌内分泌細胞にあるまま大きなハードルは、現在、非効率的なプロセスである。多くの作業が終わっほぼ30年間解明および内分泌膵臓の発達に必要な転写因子の発現プロファイルを描写しているが、ギャップは、転写因子の時間的な発現が調節され、細胞機能に関連する方法に関する我々の知識に残っている。 最近、幹細胞のフィールドは、成熟内分泌細胞のマ​​ーカーを発現する細胞の産生を駆動するために膵島開発中に一時的な転写因子発現についての蓄積された知識を採用している。ヒトES細胞や人工多能性細胞（IPSC）からのインスリン産生細胞の起源はかなり作られたが-いわゆる「ブラックボックス2に続いて膵臓前駆体転写因子）移植後のin vivo成熟を ​​発現する細胞を生成するために、1）初期のインビトロ分化：過去数年間で大幅な進歩が、最も効果的なプロトコルは、2つの異なる分化段階を必要とする&quot;期間。前進するためには、 生体内で膵島成熟の基礎となる生物学の理解の進歩に関係なく、細胞源の、生化学的レベルで理解しなければならない。のICCとのhESCを用いて得られた結果との間の類似性は、 インビトロで成熟した、グルコース応答性インスリン分泌細胞へのヒト膵臓前駆細胞の転移を制御する重要な生化学的プロセスの数が不明のままであることを示唆している。この理解の中央部分は、膵臓前駆細胞から機能的内分泌細胞集団を導出するための新規な方法を開発することとしたhESCは、生化学APPRだけを必要とする成熟事象を解明oachesが、変化を分析するためのメソッド。 なぜ我々は、ヒト胎児膵臓細胞を画像化することは、島の成熟の変化を特定の重要な側面であると考えているのですか？その答えは、インスリン産生細胞を生成するために部分的に過去の探求である。膵臓の前駆体と小島のためのモデルおよび組織培養系の両方が、研究者は、in vitroで 、動物の島およびヒト膵島 ​​の成熟の間に存在する重要な相違を探索することができました。ヒト胎児の膵臓発生の調査に限界が合法的に使用することができる胎齢のみ不均一な細胞凝集物を生じさせることである。単離されたヒト胎児細胞は、膵島、染色は在胎齢9-23週のインビトロ培養後に15％未満では、ほとんどの細胞が膵島ホルモンを染色しないで、内分泌細胞のマーカーを含んでいるが明らかに似ている。しかし、移植後および中成熟体内、細胞の大多数は、内分泌マーカーを発現する6,25。これらの研究からの結果は、 インビトロ分化後のホルモン陽性細胞の集団を増強する。 インビトロ法は、おそらくin vivoでの膵島への洞察を提供する単一のホルモン陽性内分泌細胞の適度な集団を生成することができるのhESC分化プロトコールで、今日エコーされている成熟。さらに、ヒト胎児の膵臓の開発を推進する分子事象を理解することは可能性のhESCからのインスリン産生細胞を導出し、さらにβ細胞の再生および膵臓細胞の分化転換を制御するメカニズムを描写するための努力が改善されます。 ヒト胎児の膵臓細胞とhESCの成熟の間の類似性は、細胞機能に拡張することができる。マウス細胞と同様に、ヒト胎児細胞および分化したhESCの両方が、グルコースに反応してインスリンを放出することができない体外 26,27 における膵島新生た。しかし、ヌードマウスおよび成熟、両方の人間の膵島様クラスターとのhESC展示内分泌表現型から派生したインスリン産生細胞への移植の際に。三ヶ月移植後、人口のいずれかから移植された細胞のほぼ90％がインスリン陽性であり、C-ペプチド17,26の放出によって決定された正常に機能。これらの結果は、移植膵島成熟を促進コンテキストと正体不明の手がかりを提供することを示している。ヒト胎児膵臓細胞についてここで説明したような最適化された画像プロトコルは、変調の要因を特定し、成熟を加速するために、検索に役立ちます。開発のこの段階で内分泌系統に向かって分化させたヒト胎児膵臓細胞とヒトES細胞の基本的な生化学的探査は成熟の効率を測定するために不可欠である。 Figurに概要以下のプロトコル、E 1は、全体のヒト胎児膵臓およびこれらの細胞の画像化からのICCと呼ばれるヒト胎児膵臓細胞の単離のための私たちの現在の方法を提供する。このプロトコルは、その後、単層としてまたは懸濁液中で増殖することができる組織からの細胞の初期準備を必要とする。内分泌細胞の増殖および成熟の一般的に使用されるマーカーのイメージングのための細胞の調製が記載されている。 生成と画像のICCの化学修飾剤の様々な非存在下または存在下での移植モデルに比べ、迅速な方法を提供し、完全に機能する外分泌にヒト胎児膵臓細胞の成熟を加速させる培養条件および化合物を同定するのに役立つ、乳管、またはホルモン膵臓細胞を産生する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1000">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:349px;">Trehalose SG</td>
			<td style="width:219px;">Hayashibara</td>
			<td style="width:115px;">Trehalose SG</td>
			<td style="width:319px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase XI&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-9407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI 1640 with glutamate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11879020</td>
			<td>no glucose or HEPES</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human AB Sera, Male Donors</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>HS-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fungizone</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin Solution 50 mg/ml</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1M Hepes, pH 7.0</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin - Streptomycin 100X Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hepatocyte Growth Factor (HGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GLP-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>130-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dnase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile Petri Dishes, 60 x 15 mm; Stackable, venting ribs</td>
			<td>Spectrum Laboratory Products, Inc.</td>
			<td>D210-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">16% PFA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Donkey Serum&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BrdU</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>00-0103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-insulin (mouse monclonal; 1:1000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I2018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-glucagon (mouse monoclonal; 1:2000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PDX1 (mouse monoclonal)</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP1-47910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PDX1 (goat polyclonal)</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>47383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PDX1 (rabbit polyclonal)</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>47267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFluor 546 (rabbit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFluor 546 (mouse)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFluor 488 (rabbit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFluor 488 (mouse)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ki67</td>
			<td>Lab Vision Neomarkers</td>
			<td>RM 9016-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pan-CK (mouse monoclonal; 1:100)</td>
			<td>Immunotech</td>
			<td>2128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CK19</td>
			<td>AbD Serotech</td>
			<td>MCA 2145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HTB9 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>5637</td>
			<td>see Beattie 1997 reference to generate matrix</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-6013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and imaging of human fetal pancreatic cell clusters

ほぼ30年間にわたって、科学者たちは、ヒト胎児のICCは、ヌードマウスの腎臓被膜下に移植することを実証したグルコース刺激1-9以下のヒトC-ペプチドの循環の大幅な増加によって証明されるように、機能して内分泌細胞に成熟。しかし、in vitroで、ヒト胎児のICCからのインスリン産生細胞の起源は10低い。ヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）を用いて行わ最近の実験を彷彿とさせる結果、1型糖尿病のための潜在的な治療上の処置として非常に有望で、細胞の再生可能エネルギー源。のICCのように、部分的に分化ヒトES細胞の移植は、グルコース応答、インスリン産生細胞を生成しますが、ヒトES細胞からのインスリン産生細胞の体外発生にそれほど堅牢11月17日です。内分泌前駆細胞の増殖および分化に影響を与える要因を完全に理解する可能性が高いのICCと彼の両方から生成されたデータが必要になりますサウスカロライナ州。多くのプロトコルは、 インビトロ 11月22日 、ICCを10,23,24のためのはるかに少ないEXIST にヒトES細胞からのインスリン産生細胞を生成するために存在している。その不一致の部分は、おそらく、ヒト胎児の膵臓での作業の難しさから来ている。その終わりに向かって、我々は、細胞増殖、膵臓マーカーと人間のホルモンの、12から23週までの妊娠年齢のヒト膵臓から胎児の膵島を分離するために既存の方法に構築単層としてまたは懸濁液中の細胞を成長し、画像を続けているグルカゴン及びC-ペプチドを含む。新鮮な組織6の移植によって得られたC-ペプチドレベルに類似しているヌードマウスの腎臓被膜下移植後のC-ペプチド放出をもたらすの下に記載されているプロトコルによって生成されたICC。ここに示す実施例は、膵臓内胚葉増殖およびβ細胞の発生時にフォーカスが、プロトコルは、膵臓の発達の他の側面を研究するために使用することができる、外分泌、乳管、および他のホルモン産生細胞を含む。

胎児のICCの入念な準備は、このプロトコルの成功に不可欠です。細胞は通常、めっき後に定義され期間を見て方法の代表写真を図2に示す。精製した後に、新たにメッキ細胞集合体は、少数の細胞（図2A）が含まれているような小さなスパース明確なクラスタを表示されます。最初の24時間（図2B）の後、細胞クラスターの多くは大きくなるが、多数の小さなクラスターが残る。 48時間では、クラスタは大幅に拡大したが、（図2C）、非対称のままきた。 72時間で、ICCは、サイズと形状が比較的均一（図2D）、明確にする必要があります。それは、細胞がいずれかのようなHTB-9、24時間前に、免疫蛍光、または遺伝子の発現を変化させることができる非存在下又は化学物質または薬物の存在下でさらに72時間増殖させた場合とマトリックス上に播種することができることをこの時点で膵内分泌細胞Gに必要なeneration。膵臓内胚葉に向けて、ICCの増殖や分化のいずれかを評価するために3ハイライト一般的に使用される抗体の数図 。 図3Aに、ICCをは、HTB-9上に播種した4日間増殖させ、そしてPDX1、膵臓の開発の重要なマーカーで染色した。のICC のin vitro染色は、我々の研究室で日常的に行っているが、より頻繁に、ヒト胎児のICCは、ヌードマウスの腎臓被膜下に移植し、増殖し、 生体内 6,9,30-32 で分化させる。移植後の特定の時間に、マウスを屠殺し、移植されたICCを含む腎臓を除去し、4％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋した。シーケンシャル5μmの切片をミクロトームを使用してサイト上またはコア顕微鏡施設のいずれかによって生成されます。エピトープアンマスキングおよび免疫蛍光顕微鏡用のパラフィン包埋組織からのタンパク質の染色は選択議定書3.10から3に記載されている。。細胞増殖を評価するために、およびKi67（赤）で、17は図3Bにおいて、移植されたICCは、上皮細胞マーカーパンサイトケラチン（PanCK緑色）で染色した。別の例では、ヒトインスリン（緑）、グルカゴン（赤色）の両方を、ヌードマウス（図3C）の腎臓被膜下に移植し、成熟した後に検出された。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50796/50796fig1highres.jpg" width="500" /> 図1。免疫のためのヒト胎児のICCの準備と染色のフローチャートを。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50796/50796fig2highres.jpg" width="500" /> 図2。0での代表胎児のICCの準備、めっき後24、48、または72時間（A）のICC懸濁液は直ちにめっき後、（C）48時間後のめっき、または（D）72時間をメッキした後、（B）24時間後に、めっき後に画像化した。交流のためのスケールバー、10倍の倍率= 300ミクロン、D用のスケールバー=100μmの20倍。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50796/50796fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/50796/50796fig3highres.jpg" /> 図3のメッキのICCの免疫が日常的にICCを（a）は 、膵臓内胚葉マーカーPDX1（緑）、（B）の内分泌細胞（PAN-CK;緑色）のために画像化される。と増殖（Ki67の、赤）、（c）インスリン（緑）、グルカゴン（赤色）。交流のためのスケールバー、40倍の倍率=20μmである。

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Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

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For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

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