Name: membrane-spine: a biochemical tool to identify protein-protein interactions of membrane proteins in vivo
Uploaded: 2013-11-07T19:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo at JoVE.com

وأيد هذا البحث من المنح المقدمة من جمعية الألمانية للبحوث GraKo1121، Hu1011/2-1 وSFB940 إلى SH

ملاحظة: معلومات تفصيلية عن مخازن مشار إليه في البروتوكول متاح في الجدول 1. 1. التثبيت من البروتين البروتين التفاعلات التي كتبها الفورمالديهايد عبر ربط في الخلايا الحية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لب...

<ol>
	<li>Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+transmembrane+protein+topology+with+a+hidden+markov+model:+application+to+complete+genomes.">Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes.</a> J. Mol. Biol. 305, 567-580 (2001).</li><li>Bakheet, T. M., Doig, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+and+identification+of+human+protein+drug+targets.">Properties and identification of human protein drug targets.</a> Bioinformatics. 25, 451-457 (2009).</li><li>Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-target+network.">Drug-target network.</a> Nat. Biotechnol. 25, (2007).</li><li>Daley, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+assembly+of+membrane+proteins+into+complexes.">The assembly of membrane proteins into complexes.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 420-424 (2008).</li><li>Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histidine+kinases+and+response+regulators+in+networks.">Histidine kinases and response regulators in networks.</a> Curr. Opin. Microbiol. 15, 118-124 (2012).</li><li>M&#252;ller, V. S., Jungblut, P. R., Meyer, T. F., Hunke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-SPINE:+An+improved+method+to+identify+protein-protein+interaction+partners+of+membrane+proteins+in+vivo.">Membrane-SPINE: An improved method to identify protein-protein interaction partners of membrane proteins in vivo.</a> Proteomics. 11, 2124-2128 (2011).</li><li>Herzberg, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPINE:+A+method+for+the+rapid+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions+in+vivo.">SPINE: A method for the rapid detection and analysis of protein-protein interactions in vivo.</a> Proteomics. 7, 4032-4035 (2007).</li><li>Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+formaldehyde+cross-linking+and+mass+spectrometry+in+the+study+of+protein-protein+interactions.">Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions.</a> J. Mass Spectrom. 43, 699-715 (2008).</li><li>Hernandez, P., M&#252;ller, M., Appel, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+protein+identification+by+tandem+mass+spectrometry:+Issues+and+strategies.">Automated protein identification by tandem mass spectrometry: Issues and strategies.</a> Mass Spectrom. Rev. 25, 235-254 (2006).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Hunke, S., Keller, R., M&#252;ller, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+integration+by+the+Cpx-envelope+stress+system.">Signal integration by the Cpx-envelope stress system.</a> FEMS Microbiol. Lett. 326, 12-22 (2012).</li><li>Weber, R. F., Silverman, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cpx+proteins+of+Escherichia+coli+K12+:+Structure+of+the+CpxA+polypeptide+as+an+inner+membrane+component.">The Cpx proteins of Escherichia coli K12 : Structure of the CpxA polypeptide as an inner membrane component.</a> J. Mol. Biol. 203, 467-478 (1988).</li></ol>

تحليل الغشاء العمود الفقري هو نهج البيوكيميائية التي تمكن واحد لتأكيد وتحديد لهذه النقطة شركاء التفاعل غير معروف من البروتينات الغشاء. غشاء العمود الفقري يجمع في الجسم الحي عبر ربط بواسطة الفورمالديهايد مع تنقية البروتين الطعم غشاء الموسومة بكتيريا. الجمع مع i...

لفهم وظيفة البروتين فمن الضروري أن نعرف شركاء تفاعلها. تتوفر لتحديد الشركاء التفاعل من بروتينات قابلة للذوبان العديد من التقنيات الكلاسيكية. ولكن هذه التقنيات ليست قابلة للتحويل بسهولة إلى غشاء البروتينات نظرا لطبيعة مسعور بهم 4. للتغلب على هذا القيد، وقد وضعنا في غشاء بكتيريا البروتين التفاعل التجربة (غشاء العمود الفقري) 6. لأنه يقوم على طريقة العمود الفقري، والتي كانت مناسبة فقط للبروتينات قابلة للذوبان 7. فوائد غشاء العمود الفقري من اثنين من المزايا التي تتمتع بها عبر ربط كيل الفورمالديهايد: أولا، والفورمالديهايد يمكن أن تخترق بسهولة الأغشية ويولد لقطة دقيقة من interactome خلية الحية 8 بالتالي. الثانية، والفورمالديهايد عبر وصلات يمكن عكسها من الغليان 9. هنا، يتم استخدام هذه المزايا اثنين لتحديد ليس فقط مثبطات مضخة البروتون دائمة ولكن أيضا عابرة للالمتواجد الغشاء6 الإضافية. في سطور، وتنصهر في علامة بكتيريا لمحطة سي من البروتين لا يتجزأ الطعم الغشاء. يتم تحضين الخلايا معربا عن البروتين الطعم الغشاء مع الفورمالديهايد التي عبر وصلات البروتينات فريسة للبروتين الغشاء الطعم (الشكل 1). ليست هناك حاجة للبروتينات التعديلات الفريسة. المقبل، وجزء الغشاء مستعدة. لذلك، يتم solubilized البروتينات الغشاء عن طريق العلاج المنظفات والطعم البروتينات هي التعاون مع تنقية البروتينات فريسته باستخدام تنقية تقارب. بعد ذلك، يتم عكس الرابط عبر من الغليان، ويتم فصل الطعم والبروتينات فريسة المشترك مزال من قبل SDS-PAGE. أخيرا، يمكن تحديدها من خلال تحليل البروتينات فريسة طخة مناعية أو مطياف الكتلة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="878">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">37% Formaldehyde</td>
			<td style="width:128px;">Roth</td>
			<td style="width:137px;">4979.1</td>
			<td style="width:271px;">Should not be older than one year</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DNaseI</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">DN25</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">BCA protein assay kit</td>
			<td style="width:128px;">Pierce</td>
			<td style="width:137px;">23225</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Micromagnetic rod</td>
			<td style="width:128px;">Roth</td>
			<td style="width:137px;">0955.2</td>
			<td style="width:271px;">5 mm in length, 2 mm in diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:128px;">Roth</td>
			<td style="width:137px;">6683.1</td>
			<td style="width:271px;">standard detergent for solubilization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">n-Dodecyl-&#946;-maltoside</td>
			<td style="width:128px;">Glycon</td>
			<td style="width:137px;">D97002-C</td>
			<td style="width:271px;">the best detergent to solubilze CpxA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column</td>
			<td style="width:128px;">IBA</td>
			<td style="width:137px;">2-1207-050</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Strep-tag protein purification buffer set</td>
			<td style="width:128px;">IBA</td>
			<td style="width:137px;">2-1002-001</td>
			<td style="width:271px;">Contains buffer W and buffer E</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Amicon Ultra-4 centrifugal filter</td>
			<td style="width:128px;">Millipore</td>
			<td style="width:137px;">UFC803024</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate</td>
			<td style="width:128px;">Pierce</td>
			<td style="width:137px;">34080</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">SilverQuest Silverstaining kit</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">LC6070</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">FireSilver Staining Kit</td>
			<td style="width:128px;">Proteome Factory</td>
			<td style="width:137px;">P-S-2001</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

membrane-spine: a biochemical tool to identify protein-protein interactions of membrane proteins in vivo

بروتينات الغشاء ضرورية لبقاء الخلية، وبالتالي فهي أهداف علاجية هامة 1-3. لأنها تعمل في المجمعات 4، وأساليب لتحديد وتوصيف تفاعلاتها ضرورية 5. تحقيقا لهذه الغاية، قمنا بتطوير بكتيريا غشاء البروتين تجربة التفاعل، ودعا غشاء العمود الفقري 6. هذا الأسلوب يجمع بين المجراة عبر ربط باستخدام عكسها عبر رابط مع الفورمالديهايد تنقية تقارب من بروتين الطعم غشاء الموسومة بكتيريا. أثناء الإجراء، والبروتينات فريسة عبر ربط والتعاون مع تنقية البروتين الطعم الغشاء ومفصولة الغليان في وقت لاحق. وبالتالي، واثنين من المهام الرئيسية التي يمكن تشغيلها عند تحليل التفاعلات البروتين البروتين (مثبطات مضخة البروتون) من بروتينات الغشاء باستخدام غشاء العمود الفقري: أولا، تأكيد وجود شريك التفاعل الذي اقترحه immunoblotting، والثانية، وتحديد الشركاء التفاعل جديدة عن طريق تحليل الطيف الكتلي . وعلاوة على ذلك، حتى لآه تقارب، مثبطات مضخة البروتون هي عابرة كشفها بواسطة هذه التقنية. أخيرا، غشاء العمود الفقري قابلة للتكيف مع ما يقرب من أي نوع من الخلايا، مما يجعلها قابلة للتطبيق كأداة فحص قوية لتحديد مثبطات مضخة البروتون من البروتينات الغشاء.

تحليل الغشاء يسمح العمود الفقري المشارك تنقية البروتينات الغشاء والتفاعل عابر شركاء البروتين. يتم تحقيق تنقية شارك باستخدام عبر ربط كيل الفورمالديهايد. معلمتين حاسمة لمنع غير محددة عبر الروابط التالية: تركيز الفورمالدهايد والوقت عبر ربط. استخدام كافية، ولكن ليست م...

Watch this Scientific Journal Video about Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo at JoVE.com

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

يوصف منهج الكيمياء الحيوية في الجسم الحي لتحديد البروتين البروتين التفاعلات (PPI) للبروتينات الغشاء. أسلوب يجمع بين البروتين عبر ربط، وتنقية تقارب ومطياف الكتلة، وقابلة للتكيف مع ما يقرب من أي نوع من الخلايا أو الكائن الحي. مع هذا النهج، وحتى تحديد مثبطات مضخة البروتون عابرة يصبح ذلك ممكنا.

غشاء العمود الفقري: أداة كيميائية حيوية لتحديد البروتين البروتين التفاعلات للبروتينات الغشاء<em&gt; في فيفو</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

تصنيع أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية الدنا للكشف Reagentless من الأحماض النووية والبروتينات والجزيئات الصغيرة

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

تصور البروتينات والمجمعات ضخم الجزيئات التي كتبها EM اللطخة السلبية : من إعداد الشبكة إلى الحصول على الصور

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

تصميم مفاعل حيوي لضغط الدوري السابقين فيفو دراسة صمامات القلب الأورطي

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

تحديد معدل النقل من الاكسيوبيوتك والمواد النانوية عبر المشيمة باستخدام<em&gt; خارج الحي</em&gt; الإنسان المشيمة الإرواء الموديل

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Isolation and Characterization Of Chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow

عزل وتوصيف البروتينات التعبير عن مدينة Chimeric الإنسان باستخدام البروتين A غشاء Adsorbers وسير عمل مبسطة

Laboratory scale to industrial scale purification of biomolecules from cell culture supernatants and lysed cell solutions can be accomplished using ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

نقل التلألؤ الرنين الطاقة لدراسة التغييرات بتكوين جزئي في غشاء البروتينات أعرب في خلايا الثدييات

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

مضان تبريد لالقريبة من الأشعة تحت الحمراء Fluorophore-مغلفة Liposomal كأداة لل<em&gt; في فيفو</em&gt; التصوير الضوئي

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Microenvironments-شطيرة مثل لتسخير خلية / المواد التفاعلات

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

إعداد 3D الهلام الكولاجين وMicrochannels لدراسة التفاعلات 3D<em&gt; في فيفو</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

النانومترية الحمض النووي كأداة مرنة لدراسة البوليمرات سيميفليكسيبلي

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...