Name: membrane-spine: a biochemical tool to identify protein-protein interactions of membrane proteins in vivo
Uploaded: 2013-11-07T19:35:00
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Diese Arbeit wurde durch Fördermittel der Deutschen Forschungsgemeinschaft GraKo1121, Hu1011/2-1 und SFB940 SH unterstützt

Hinweis: Detaillierte Informationen zur Puffer im Protokoll angegeben ist in Tabelle 1 verfügbar. 1. Fixierung von Protein-Protein-Interaktionen durch Formaldehyd-Vernetzungs in lebenden Zellen <ol><li> Um zu beginnen vorzubereiten Wachstumsmedien, Stammlösungen und Puffer P1 <ol><li> Bereiten 500 ml Medium: Das Medium sollte Bedingungen, die die Wechselwirkung zwischen Membran Köderprotein und Beuteproteine ​​unterstützen. Darüber hinaus sollte ein Versuch unter ...

<ol>
	<li>Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+transmembrane+protein+topology+with+a+hidden+markov+model:+application+to+complete+genomes.">Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes.</a> J. Mol. Biol. 305, 567-580 (2001).</li><li>Bakheet, T. M., Doig, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+and+identification+of+human+protein+drug+targets.">Properties and identification of human protein drug targets.</a> Bioinformatics. 25, 451-457 (2009).</li><li>Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-target+network.">Drug-target network.</a> Nat. Biotechnol. 25, (2007).</li><li>Daley, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+assembly+of+membrane+proteins+into+complexes.">The assembly of membrane proteins into complexes.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 420-424 (2008).</li><li>Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histidine+kinases+and+response+regulators+in+networks.">Histidine kinases and response regulators in networks.</a> Curr. Opin. Microbiol. 15, 118-124 (2012).</li><li>M&#252;ller, V. S., Jungblut, P. R., Meyer, T. F., Hunke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-SPINE:+An+improved+method+to+identify+protein-protein+interaction+partners+of+membrane+proteins+in+vivo.">Membrane-SPINE: An improved method to identify protein-protein interaction partners of membrane proteins in vivo.</a> Proteomics. 11, 2124-2128 (2011).</li><li>Herzberg, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPINE:+A+method+for+the+rapid+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions+in+vivo.">SPINE: A method for the rapid detection and analysis of protein-protein interactions in vivo.</a> Proteomics. 7, 4032-4035 (2007).</li><li>Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+formaldehyde+cross-linking+and+mass+spectrometry+in+the+study+of+protein-protein+interactions.">Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions.</a> J. Mass Spectrom. 43, 699-715 (2008).</li><li>Hernandez, P., M&#252;ller, M., Appel, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+protein+identification+by+tandem+mass+spectrometry:+Issues+and+strategies.">Automated protein identification by tandem mass spectrometry: Issues and strategies.</a> Mass Spectrom. Rev. 25, 235-254 (2006).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Hunke, S., Keller, R., M&#252;ller, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+integration+by+the+Cpx-envelope+stress+system.">Signal integration by the Cpx-envelope stress system.</a> FEMS Microbiol. Lett. 326, 12-22 (2012).</li><li>Weber, R. F., Silverman, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cpx+proteins+of+Escherichia+coli+K12+:+Structure+of+the+CpxA+polypeptide+as+an+inner+membrane+component.">The Cpx proteins of Escherichia coli K12 : Structure of the CpxA polypeptide as an inner membrane component.</a> J. Mol. Biol. 203, 467-478 (1988).</li></ol>

Membran SPINE Analyse ist ein biochemischer Ansatz, ermöglicht ein, um zu bestätigen und um zu diesem Punkt unbekannte Interaktionspartner von Membranproteinen zu identifizieren. Membran SPINE vereint in vivo Vernetzung durch Formaldehyd mit Reinigung eines Strep-markierten Membranköderprotein. Die Kombination mit Immunoblotting erleichtert den Nachweis von vorhergesagten Wechselwirkungspartner (Fig. 2). Zusätzlich wird die Verbindung mit MS-Analyse erlaubt die Identifikation unbekannter In...

Um die Funktion eines Proteins zu verstehen, ist es wichtig, seinen Interaktionspartnern kennen. Mehreren klassischen Techniken zur Identifizierung von Interaktionspartnern von löslichen Proteinen zur Verfügung. Jedoch sind diese Techniken nicht ohne weiteres übertragbar, um Proteine ​​aufgrund ihrer hydrophoben Natur 4 Membran. Um diese Einschränkung zu überwinden, haben wir die Membran Strep-Protein-Wechselwirkung Experiment (Membran-spine) 6 entwickelt. Es basiert auf der Methode DORN, die nur für lösliche Proteine ​​geeignet war 7 basiert. Membran-SPINE profitiert von zwei Vorteile des Vernetzungsmittels Formaldehyd: erste Formaldehyd kann leicht durchdringen Membranen und erzeugt eine genaue Momentaufnahme der Interaktom einer lebenden Zelle 8 daher. Zweitens kann Formaldehyd vernetzt durch Kochen 9 umgekehrt werden. Hier werden diese beiden Vorteile verwendet, um nicht nur dauerhaft, sondern auch vorübergehende PPI Membran Prote identifizierenIns 6. Kurz gesagt, ein Strep-Tag an den C-Terminus des integralen Membranköderprotein fusioniert ist. Zellen, die den Membranköderprotein exprimieren, werden mit Formaldehyd vernetzt Beute-Proteine ​​an die Membran Köder-Protein (Fig. 1) inkubiert. Modifikationen der Beuteproteine ​​sind nicht erforderlich. Als nächstes wird die Membranfraktion bereit. Daher sind Membranproteine ​​durch Detergens-Behandlung und Köder-Proteine ​​sind mit ihrer Beute Proteinen unter Verwendung von Affinitätsreinigung gereinigt Zusammenarbeit gelöst. Anschließend wird die Vernetzung durch Kochen umgekehrt, und der Köder und deren koeluierte Beute-Proteine ​​werden durch SDS-PAGE getrennt. Schließlich kann Beuteproteine ​​durch Immunoblot-Analyse bzw. Massenspektroskopie identifiziert werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="878">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">37% Formaldehyde</td>
			<td style="width:128px;">Roth</td>
			<td style="width:137px;">4979.1</td>
			<td style="width:271px;">Should not be older than one year</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DNaseI</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">DN25</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">BCA protein assay kit</td>
			<td style="width:128px;">Pierce</td>
			<td style="width:137px;">23225</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Micromagnetic rod</td>
			<td style="width:128px;">Roth</td>
			<td style="width:137px;">0955.2</td>
			<td style="width:271px;">5 mm in length, 2 mm in diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:128px;">Roth</td>
			<td style="width:137px;">6683.1</td>
			<td style="width:271px;">standard detergent for solubilization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">n-Dodecyl-&#946;-maltoside</td>
			<td style="width:128px;">Glycon</td>
			<td style="width:137px;">D97002-C</td>
			<td style="width:271px;">the best detergent to solubilze CpxA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column</td>
			<td style="width:128px;">IBA</td>
			<td style="width:137px;">2-1207-050</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Strep-tag protein purification buffer set</td>
			<td style="width:128px;">IBA</td>
			<td style="width:137px;">2-1002-001</td>
			<td style="width:271px;">Contains buffer W and buffer E</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Amicon Ultra-4 centrifugal filter</td>
			<td style="width:128px;">Millipore</td>
			<td style="width:137px;">UFC803024</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate</td>
			<td style="width:128px;">Pierce</td>
			<td style="width:137px;">34080</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">SilverQuest Silverstaining kit</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">LC6070</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">FireSilver Staining Kit</td>
			<td style="width:128px;">Proteome Factory</td>
			<td style="width:137px;">P-S-2001</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

membrane-spine: a biochemical tool to identify protein-protein interactions of membrane proteins in vivo

Membranproteine ​​sind essentiell für die Lebensfähigkeit der Zellen und sind daher wichtige therapeutische Ziele 3.1. Da sie in den Komplexen 4 funktionieren, sind Methoden zur Identifizierung und Charakterisierung ihrer Wechselwirkungen notwendig 5. Zu diesem Zweck haben wir die Membran Strep-Protein-Wechselwirkung Experiment genannt Membran-Dorn 6. Diese Technik kombiniert in vivo Vernetzen unter Verwendung des reversiblen Vernetzungsmittel Formaldehyd mit Affinitätsreinigung von Strep-tag eine Membran Köderprotein. Während des Verfahrens sind vernetzte Beuteproteine ​​mit der Membran Köderprotein co-gereinigt und anschließend durch Kochen getrennt. Daher können zwei wichtige Aufgaben bei der Analyse von Protein-Protein-Interaktionen (PPI) von Membranproteinen mit Membran-Dorn ausgeführt werden: erstens die Bestätigung einer vorgeschlagenen Interaktionspartner durch Immunoblotting, und zweitens die Identifizierung neuer Interaktionspartner von Massenspektrometrie-Analyse . Außerdem, selbst low Affinität, sind vorübergehende PPI durch diese Technik nachweisbar. Schließlich ist Membran-SPINE anpassungsfähig an nahezu jeden Zelltyp, so dass es zutreffend als ein leistungsfähiges Werkzeug, um Screening PPI von Membranproteinen zu identifizieren.

Membran SPINE-Analyse erlaubt die Co-Reinigung von Membranproteinen und transient interacting protein Partnern. Die Co-Reinigung unter Verwendung der Vernetzungsmittel Formaldehyd erreicht. Zwei Parameter sind wichtig, um unspezifische Vernetzungen verhindern: die Formaldehyd-Konzentration und der Vernetzungszeit. Die ausreichende, aber nicht übermäßige Verwendung von Formaldehyd kann leicht durch Immunoblotting gesteuert werden. Formaldehyd vernetztem Protein-Komplexe durch Kochen aber nicht durch SDS-Behandlung abg...

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Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Eine biochemische Ansatz beschrieben, um die in vivo-Protein-Protein-Interaktionen (PPI) der Membranproteine ​​zu identifizieren. Das Verfahren kombiniert Proteinvernetzung, Affinitätsreinigung und Massenspektrometrie, und ist an fast jedem Zelltyp oder Organismus. Mit diesem Ansatz wird auch die Identifizierung der transienten PPI möglich.

Membran-DORN: Ein Tool, um biochemische Protein-Protein-Interaktionen von Membranproteinen Identifizieren<em&gt; In Vivo</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Herstellung von elektrochemischen DNA Biosensoren für die Reagenzienfreier Nachweis von Nukleinsäuren, Proteinen und kleinen Molekülen

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

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