Name: membrane-spine: a biochemical tool to identify protein-protein interactions of membrane proteins in vivo
Uploaded: 2013-11-07T19:35:00
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Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni della Deutsche Forschungsgemeinschaft GraKo1121, Hu1011/2-1 e SFB940 di SH

Nota: Le informazioni per i buffer indicati nel protocollo è disponibile in Tabella 1. 1. Fissazione delle interazioni proteina-proteina da formaldeide Cross-linking nelle cellule viventi <ol><li> Per iniziare a preparare i terreni di crescita, soluzioni madre e tampone P1 <ol><li> Preparare medie 500 ml: Il mezzo deve offrire le condizioni che supportano l&#39;interazione tra proteina di membrana esca e proteine ​​preda. Inoltre, un esperimento deve essere effettuato...

<ol>
	<li>Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+transmembrane+protein+topology+with+a+hidden+markov+model:+application+to+complete+genomes.">Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes.</a> J. Mol. Biol. 305, 567-580 (2001).</li><li>Bakheet, T. M., Doig, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+and+identification+of+human+protein+drug+targets.">Properties and identification of human protein drug targets.</a> Bioinformatics. 25, 451-457 (2009).</li><li>Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-target+network.">Drug-target network.</a> Nat. Biotechnol. 25, (2007).</li><li>Daley, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+assembly+of+membrane+proteins+into+complexes.">The assembly of membrane proteins into complexes.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 420-424 (2008).</li><li>Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histidine+kinases+and+response+regulators+in+networks.">Histidine kinases and response regulators in networks.</a> Curr. Opin. Microbiol. 15, 118-124 (2012).</li><li>M&#252;ller, V. S., Jungblut, P. R., Meyer, T. F., Hunke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-SPINE:+An+improved+method+to+identify+protein-protein+interaction+partners+of+membrane+proteins+in+vivo.">Membrane-SPINE: An improved method to identify protein-protein interaction partners of membrane proteins in vivo.</a> Proteomics. 11, 2124-2128 (2011).</li><li>Herzberg, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPINE:+A+method+for+the+rapid+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions+in+vivo.">SPINE: A method for the rapid detection and analysis of protein-protein interactions in vivo.</a> Proteomics. 7, 4032-4035 (2007).</li><li>Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+formaldehyde+cross-linking+and+mass+spectrometry+in+the+study+of+protein-protein+interactions.">Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions.</a> J. Mass Spectrom. 43, 699-715 (2008).</li><li>Hernandez, P., M&#252;ller, M., Appel, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+protein+identification+by+tandem+mass+spectrometry:+Issues+and+strategies.">Automated protein identification by tandem mass spectrometry: Issues and strategies.</a> Mass Spectrom. Rev. 25, 235-254 (2006).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Hunke, S., Keller, R., M&#252;ller, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+integration+by+the+Cpx-envelope+stress+system.">Signal integration by the Cpx-envelope stress system.</a> FEMS Microbiol. Lett. 326, 12-22 (2012).</li><li>Weber, R. F., Silverman, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cpx+proteins+of+Escherichia+coli+K12+:+Structure+of+the+CpxA+polypeptide+as+an+inner+membrane+component.">The Cpx proteins of Escherichia coli K12 : Structure of the CpxA polypeptide as an inner membrane component.</a> J. Mol. Biol. 203, 467-478 (1988).</li></ol>

Analisi membrana colonna vertebrale è un approccio biochimico che permette di confermare e per identificare a questo punto sconosciuti partner di interazione di proteine ​​di membrana. Membrana SPINE combina in vivo reticolazione da formaldeide con purificazione di una proteina di membrana esca Strep-tag. La combinazione con immunoblotting facilita la conferma di partner di interazione previsti (Figura 2). Inoltre, la combinazione con analisi MS consente l&#39;identificazione di partner di...

Per comprendere la funzione di una proteina è fondamentale conoscere i suoi partner di interazione. Diverse tecniche classiche sono disponibili per l&#39;identificazione di partner di interazione di proteine ​​solubili. Tuttavia, queste tecniche non sono facilmente trasferibili ad proteine ​​della membrana a causa della loro natura idrofoba 4. Per superare questa limitazione, abbiamo sviluppato il Strep-proteina esperimento di interazione membrana (Membrane-SPINE) 6. Si basa sul metodo colonna vertebrale, che è adatto solo per le proteine ​​solubili 7. Benefici membrana e colonna vertebrale da due vantaggi della formaldeide agente reticolante: primo, formaldeide possono facilmente penetrare le membrane e quindi genera un&#39;istantanea precisa dell&#39;interattoma di una cellula vivente 8. In secondo luogo, formaldeide cross-link possono essere invertite bollendo 9. Qui, questi due vantaggi sono utilizzati per identificare non solo gli IPP permanenti, ma anche transitori di membrana proteins 6. In breve, un Strep-tag è fuso al C-terminale della proteina di membrana integrale esca. Cellule che esprimono la proteina esca membrane vengono incubate con formaldeide che legami incrociati preda proteine ​​alla proteina esca membrana (Figura 1). Non sono necessarie modificazioni delle proteine ​​preda. Successivamente, la frazione di membrana è disposta. Pertanto, proteine ​​di membrana vengono solubilizzati mediante trattamento detergente e esca proteine ​​sono co-purificati con le sue proteine ​​preda utilizzando purificazione per affinità. Successivamente, il cross-link è invertita mediante ebollizione, e l&#39;esca e le sue proteine ​​preda co-eluiti sono separati mediante SDS-PAGE. Infine, le proteine ​​preda possono essere identificati mediante analisi immunoblot o spettrometria di massa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="878">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">37% Formaldehyde</td>
			<td style="width:128px;">Roth</td>
			<td style="width:137px;">4979.1</td>
			<td style="width:271px;">Should not be older than one year</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DNaseI</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">DN25</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">BCA protein assay kit</td>
			<td style="width:128px;">Pierce</td>
			<td style="width:137px;">23225</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Micromagnetic rod</td>
			<td style="width:128px;">Roth</td>
			<td style="width:137px;">0955.2</td>
			<td style="width:271px;">5 mm in length, 2 mm in diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:128px;">Roth</td>
			<td style="width:137px;">6683.1</td>
			<td style="width:271px;">standard detergent for solubilization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">n-Dodecyl-&#946;-maltoside</td>
			<td style="width:128px;">Glycon</td>
			<td style="width:137px;">D97002-C</td>
			<td style="width:271px;">the best detergent to solubilze CpxA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column</td>
			<td style="width:128px;">IBA</td>
			<td style="width:137px;">2-1207-050</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Strep-tag protein purification buffer set</td>
			<td style="width:128px;">IBA</td>
			<td style="width:137px;">2-1002-001</td>
			<td style="width:271px;">Contains buffer W and buffer E</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Amicon Ultra-4 centrifugal filter</td>
			<td style="width:128px;">Millipore</td>
			<td style="width:137px;">UFC803024</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate</td>
			<td style="width:128px;">Pierce</td>
			<td style="width:137px;">34080</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">SilverQuest Silverstaining kit</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">LC6070</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">FireSilver Staining Kit</td>
			<td style="width:128px;">Proteome Factory</td>
			<td style="width:137px;">P-S-2001</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

membrane-spine: a biochemical tool to identify protein-protein interactions of membrane proteins in vivo

Le proteine ​​di membrana sono essenziali per la vitalità delle cellule e sono quindi importanti bersagli terapeutici 1-3. Dal momento che funzionano in complessi 4, sono necessari metodi per identificare e caratterizzare le loro interazioni 5. A questo scopo, abbiamo sviluppato l&#39;esperimento di interazione Strep-proteina di membrana, denominata membrana SPINE 6. Questa tecnica combina in vivo reticolazione usando l&#39;reversibile reticolante formaldeide con purificazione per affinità di una proteina di membrana esca Strep-tag. Durante la procedura, proteine ​​preda reticolati sono co-purificati con la proteina esca membrana e successivamente separati mediante ebollizione. Quindi, due compiti principali possono essere eseguiti quando si analizzano le interazioni proteina-proteina (PPI) di proteine ​​di membrana con membrana SPINE: in primo luogo, la conferma di un partner di interazione proposto da immunoblotting, e in secondo luogo, l&#39;individuazione di nuovi partner di interazione mediante analisi di spettrometria di massa . Inoltre, anche low affinità, PPI transitori sono rilevabili da questa tecnica. Infine, membrana SPINE è adattabile a quasi ogni tipo di cellula, che lo rende applicabile come strumento di screening potente per identificare PPI di proteine ​​di membrana.

Analisi membrana SPINE permette la co-purificazione di proteine ​​di membrana e transitoriamente interagenti partner proteici. Il co-purificazione è ottenuto utilizzando l&#39;agente formaldeide reticolazione. Due parametri sono fondamentali per evitare aspecifiche legami incrociati: la concentrazione di formaldeide e il tempo di reticolazione. L&#39;uso sufficiente, ma non eccessivo di formaldeide può essere facilmente controllato mediante immunoblotting. Complessi proteici formaldeide reticolati possono essere s...

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Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Un approccio biochimico è descritto per identificare in vivo interazioni proteina-proteina (PPI) di proteine ​​di membrana. Il metodo combina proteina reticolazione, purificazione per affinità e spettrometria di massa, ed è adattabile a qualsiasi tipo cellula o organismo. Con questo approccio, anche l&#39;identificazione degli IPP transitori diventa possibile.

Membrana-SPINE: uno strumento biochimici per identificare interazioni proteina-proteina di proteine ​​di membrana<em&gt; In Vivo</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

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Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

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