Name: membrane-spine: a biochemical tool to identify protein-protein interactions of membrane proteins in vivo
Uploaded: 2013-11-07T19:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet med tilskudd av Deutsche Forschungsgemeinschaft GraKo1121, Hu1011/2-1 og SFB940 til SH

Merk: Detaljert informasjon om buffere angitt i protokollen er tilgjengelig i tabell 1. En. Fiksering av protein-protein interaksjoner ved Formaldehyd Cross-linking i levende celler <ol><li> For å begynne å forberede vekstmedier, stamløsninger og buffer P1 <ol><li> Forbered 500 ml medium: Mediet bør gi forhold som støtter samspillet mellom membran agn protein og byttedyr proteiner. I tillegg bør et eksperiment utføres under betingelser hvor det ikke forventet intera...

<ol>
	<li>Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+transmembrane+protein+topology+with+a+hidden+markov+model:+application+to+complete+genomes.">Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes.</a> J. Mol. Biol. 305, 567-580 (2001).</li><li>Bakheet, T. M., Doig, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+and+identification+of+human+protein+drug+targets.">Properties and identification of human protein drug targets.</a> Bioinformatics. 25, 451-457 (2009).</li><li>Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-target+network.">Drug-target network.</a> Nat. Biotechnol. 25, (2007).</li><li>Daley, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+assembly+of+membrane+proteins+into+complexes.">The assembly of membrane proteins into complexes.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 420-424 (2008).</li><li>Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histidine+kinases+and+response+regulators+in+networks.">Histidine kinases and response regulators in networks.</a> Curr. Opin. Microbiol. 15, 118-124 (2012).</li><li>M&#252;ller, V. S., Jungblut, P. R., Meyer, T. F., Hunke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-SPINE:+An+improved+method+to+identify+protein-protein+interaction+partners+of+membrane+proteins+in+vivo.">Membrane-SPINE: An improved method to identify protein-protein interaction partners of membrane proteins in vivo.</a> Proteomics. 11, 2124-2128 (2011).</li><li>Herzberg, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPINE:+A+method+for+the+rapid+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions+in+vivo.">SPINE: A method for the rapid detection and analysis of protein-protein interactions in vivo.</a> Proteomics. 7, 4032-4035 (2007).</li><li>Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+formaldehyde+cross-linking+and+mass+spectrometry+in+the+study+of+protein-protein+interactions.">Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions.</a> J. Mass Spectrom. 43, 699-715 (2008).</li><li>Hernandez, P., M&#252;ller, M., Appel, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+protein+identification+by+tandem+mass+spectrometry:+Issues+and+strategies.">Automated protein identification by tandem mass spectrometry: Issues and strategies.</a> Mass Spectrom. Rev. 25, 235-254 (2006).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Hunke, S., Keller, R., M&#252;ller, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+integration+by+the+Cpx-envelope+stress+system.">Signal integration by the Cpx-envelope stress system.</a> FEMS Microbiol. Lett. 326, 12-22 (2012).</li><li>Weber, R. F., Silverman, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cpx+proteins+of+Escherichia+coli+K12+:+Structure+of+the+CpxA+polypeptide+as+an+inner+membrane+component.">The Cpx proteins of Escherichia coli K12 : Structure of the CpxA polypeptide as an inner membrane component.</a> J. Mol. Biol. 203, 467-478 (1988).</li></ol>

Membran SPINE analyse er en biokjemisk tilnærming som gjør det mulig å bekrefte og for å identifisere til dette punktet ukjente interaksjons partnere av membran proteiner. Membranryggraden kombinerer in vivo tverrbinding av formaldehyd med rensing av et Strep-kodet membranprotein agn. Kombinasjonen med immunoblotting muliggjør bekreftelse av predikerte interaksjonspartnere (figur 2). I tillegg er kombinasjon med MS-analyse gjør det mulig å identifisere ukjente interaksjonspartnere <stron...

For å forstå funksjonen til et protein er det viktig å kjenne dens interaksjonspartnere. Flere klassiske teknikker er tilgjengelige for identifisering av interaksjonspartnere av oppløselige proteiner. Imidlertid er disse teknikker ikke er lett overførbar til membran proteiner på grunn av deres hydrofobe natur 4.. For å overkomme denne begrensningen, har vi utviklet Membrane Strep-protein interaksjon eksperiment (Membran-SPINE) 6. Den er basert på ryggraden metode, som bare er egnet for løselige proteiner 7. Membran-ryggraden fordeler fra to fordeler ved den tverrbindende middel formaldehyd: for det første kan formaldehyd lett trenge gjennom membraner, og således genererer en nøyaktig bilde av interactome av en levende celle 8.. For det andre, kan formaldehyd kryssbindinger bli reversert ved å koke ni. Her er disse to fordeler brukt til å identifisere ikke bare faste, men også forbigående PPIer av membranen proteins seks. I korte trekk, er en streptokokk-tag smeltet til C-enden av integrert membran agn protein. Celler som uttrykker membran agn protein blir inkubert med formaldehyd som tverrbinder proteinene tære til membranen agn protein (figur 1). Modifikasjoner av byttedyr proteiner er ikke nødvendig. Det neste er at membranfraksjonen forberedt. Derfor er membranproteiner oppløseliggjøres ved såpebehandling og agn proteiner er ko-renset med byttedyr proteiner ved hjelp av affinitetsrensing. Derpå blir det kryss-kobling reverseres ved koking, og agnet og dets ko-eluerte byttedyr proteiner blir separert ved SDS-PAGE. Endelig kan byttedyr proteiner bli identifisert ved immunoblotanalyse eller massespektrometri.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="878">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">37% Formaldehyde</td>
			<td style="width:128px;">Roth</td>
			<td style="width:137px;">4979.1</td>
			<td style="width:271px;">Should not be older than one year</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DNaseI</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">DN25</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">BCA protein assay kit</td>
			<td style="width:128px;">Pierce</td>
			<td style="width:137px;">23225</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Micromagnetic rod</td>
			<td style="width:128px;">Roth</td>
			<td style="width:137px;">0955.2</td>
			<td style="width:271px;">5 mm in length, 2 mm in diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:128px;">Roth</td>
			<td style="width:137px;">6683.1</td>
			<td style="width:271px;">standard detergent for solubilization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">n-Dodecyl-&#946;-maltoside</td>
			<td style="width:128px;">Glycon</td>
			<td style="width:137px;">D97002-C</td>
			<td style="width:271px;">the best detergent to solubilze CpxA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column</td>
			<td style="width:128px;">IBA</td>
			<td style="width:137px;">2-1207-050</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Strep-tag protein purification buffer set</td>
			<td style="width:128px;">IBA</td>
			<td style="width:137px;">2-1002-001</td>
			<td style="width:271px;">Contains buffer W and buffer E</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Amicon Ultra-4 centrifugal filter</td>
			<td style="width:128px;">Millipore</td>
			<td style="width:137px;">UFC803024</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate</td>
			<td style="width:128px;">Pierce</td>
			<td style="width:137px;">34080</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">SilverQuest Silverstaining kit</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">LC6070</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">FireSilver Staining Kit</td>
			<td style="width:128px;">Proteome Factory</td>
			<td style="width:137px;">P-S-2001</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

membrane-spine: a biochemical tool to identify protein-protein interactions of membrane proteins in vivo

Membranproteiner er essensielle for cellelevedyktighet og er derfor viktige terapeutiske mål 1-3. Siden de fungerer i komplekser 4, metoder for å identifisere og karakterisere deres interaksjoner er nødvendig fem. For å oppnå dette, har vi utviklet Membrane Strep-protein interaksjon eksperiment, kalt Membran-SPINE seks. Denne teknikken kombinerer in vivo tverrbinding ved bruk av den reversible tverrbinder formaldehyd med affinitetsrensing av Strep-kodet membranprotein agn. I løpet av fremgangsmåten, fornettede proteiner byttedyr er ko-renset med membranen agn protein og deretter separert ved koking. Derfor kan to store oppgaver utføres når analysere protein-protein interaksjoner (PPI) av membran proteiner ved hjelp av membran-SPINE: først, en bekreftelse av en foreslått interaksjon partner ved immuno, og andre, identifisering av nye interaksjonspartnere ved massespektrometri analyse . Dessuten, selv low affinitet, forbigående PPIs kan påvises ved denne teknikken. Endelig er Membran-SPINE tilpasses nesten alle celletype, noe som gjør det aktuelt som et kraftig screening verktøy for å identifisere PPIs av membran proteiner.

Membran SPINE analyse gjør at co-rensing av membran proteiner og forbigående samspill protein partnere. Den ko-rensing oppnås ved hjelp av kryssbindingsmiddel formaldehyd. To parametere er kritiske for å hindre at uspesifikke kryssbindinger: formaldehydkonsentrasjon og kryssbindingen time. Det er tilstrekkelig, men ikke overdreven bruk av formaldehyd kan lett kontrolleres ved immunoblotting. Formaldehyd fornettede proteinkomplekser kan bli separert ved å koke, men ikke ved hjelp av SDS-behandling. Derfor kan de bli...

Watch this Scientific Journal Video about Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo at JoVE.com

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

En biokjemisk tilnærming er beskrevet å identifisere in vivo protein-protein interaksjoner (PPI) av membran proteiner. Metoden kombinerer proteintverrbinding, affinitetsrensing og massespektrometri, og kan tilpasses til nesten en hvilken som helst celletype eller organisme. Med denne fremgangsmåten, blir til og identifisering av transiente PPIer mulig.

Membran-SPINE: En Biokjemisk verktøy for å identifisere protein-protein interaksjoner av membran proteiner<em&gt; I Vivo</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Visualisere Proteiner og makromolekylær komplekser ved Negative Stain EM: fra Grid Forberedelse til Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Fastsettelse av Transport Valuta xenobiotics og nanomaterialer over placenta ved hjelp<em&gt; Ex vivo</em&gt; Menneskelig placentaperfusjon Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Isolation and Characterization Of Chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow

Isolasjon og karakterisering av chimeric human fc-uttrykkende proteiner ved hjelp av protein A membrane adsorbere og en strømlinjeformet arbeidsflyt

Laboratory scale to industrial scale purification of biomolecules from cell culture supernatants and lysed cell solutions can be accomplished using ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescence Resonance Energy Transfer til Studer konformasjonsendringer i membran proteiner uttrykt i pattedyrceller

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescens-slukking av en Liposomalinnkapslet Nær-infrarød fluoroforen som et verktøy for<em&gt; I Vivo</em&gt; Optisk Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Sandwich-lignende microenvironments å utnytte Cell / Material Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Utarbeidelse av 3D kollagen Gels og mikro for studier av 3D Interaksjoner<em&gt; I Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

DNA nanorør som et allsidig verktøy for å studere Semiflexible polymerer

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...