Name: membrane-spine: a biochemical tool to identify protein-protein interactions of membrane proteins in vivo
Uploaded: 2013-11-07T19:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo at JoVE.com

Denna forskning har finansierats med bidrag från Deutsche Forschungsgemeinschaft GraKo1121, Hu1011/2-1 och SFB940 till SH

Obs: Detaljerad information om buffertar i protokollet finns i tabell 1. 1. Fixering av protein-proteininteraktioner genom Formaldehyd Tvärbindning i levande celler <ol><li> Till att börja förbereda tillväxtmedier, lagerlösningar och buffert P1 <ol><li> Bered 500 ml medium: Mediet bör ge förutsättningar som stödjer interaktionen mellan membranbetesprotein och bytesproteiner. Dessutom bör ett experiment utföras under betingelser där ingen interaktion förväntas...

<ol>
	<li>Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+transmembrane+protein+topology+with+a+hidden+markov+model:+application+to+complete+genomes.">Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes.</a> J. Mol. Biol. 305, 567-580 (2001).</li><li>Bakheet, T. M., Doig, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+and+identification+of+human+protein+drug+targets.">Properties and identification of human protein drug targets.</a> Bioinformatics. 25, 451-457 (2009).</li><li>Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-target+network.">Drug-target network.</a> Nat. Biotechnol. 25, (2007).</li><li>Daley, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+assembly+of+membrane+proteins+into+complexes.">The assembly of membrane proteins into complexes.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 420-424 (2008).</li><li>Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histidine+kinases+and+response+regulators+in+networks.">Histidine kinases and response regulators in networks.</a> Curr. Opin. Microbiol. 15, 118-124 (2012).</li><li>M&#252;ller, V. S., Jungblut, P. R., Meyer, T. F., Hunke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-SPINE:+An+improved+method+to+identify+protein-protein+interaction+partners+of+membrane+proteins+in+vivo.">Membrane-SPINE: An improved method to identify protein-protein interaction partners of membrane proteins in vivo.</a> Proteomics. 11, 2124-2128 (2011).</li><li>Herzberg, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPINE:+A+method+for+the+rapid+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions+in+vivo.">SPINE: A method for the rapid detection and analysis of protein-protein interactions in vivo.</a> Proteomics. 7, 4032-4035 (2007).</li><li>Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+formaldehyde+cross-linking+and+mass+spectrometry+in+the+study+of+protein-protein+interactions.">Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions.</a> J. Mass Spectrom. 43, 699-715 (2008).</li><li>Hernandez, P., M&#252;ller, M., Appel, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+protein+identification+by+tandem+mass+spectrometry:+Issues+and+strategies.">Automated protein identification by tandem mass spectrometry: Issues and strategies.</a> Mass Spectrom. Rev. 25, 235-254 (2006).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Hunke, S., Keller, R., M&#252;ller, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+integration+by+the+Cpx-envelope+stress+system.">Signal integration by the Cpx-envelope stress system.</a> FEMS Microbiol. Lett. 326, 12-22 (2012).</li><li>Weber, R. F., Silverman, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cpx+proteins+of+Escherichia+coli+K12+:+Structure+of+the+CpxA+polypeptide+as+an+inner+membrane+component.">The Cpx proteins of Escherichia coli K12 : Structure of the CpxA polypeptide as an inner membrane component.</a> J. Mol. Biol. 203, 467-478 (1988).</li></ol>

Membran SPINE Analys är en biokemisk metod som gör det möjligt att bekräfta och fastställa till denna punkt okända interaktionspartner för membranproteiner. Membran SPINE kombinerar in vivo tvärbindning av formaldehyd med rening av en Strep-märkta membranbetesprotein. Kombinationen med immunoblotting underlättar bekräftelse av förutsagda interaktionspartner (Figur 2). Dessutom kan kombinationen med MS-analys möjliggör identifiering av okända interaktionspartner (Figur 3)....

För att förstå funktionen hos ett protein är det viktigt att känna till dess interaktionspartners. Flera klassiska tekniker finns tillgängliga för identifieringen av interaktionspartner av lösliga proteiner. Dessa tekniker är emellertid inte lätt överföras till membranproteiner på grund av deras hydrofoba natur 4. För att övervinna denna begränsning, har vi utvecklat Membrane Strep-proteininteraktion experiment (Membran-SPINE) 6. Den är baserad på ryggraden metod, som var endast lämplig för lösliga proteiner 7. Membran-ryggen fördelar från två fördelar med tvärbindningsmedlet formaldehyd: för det första kan formaldehyd lätt penetrera membraner och alstrar en exakt bild av den interactome hos en levande cell 8 därför. För det andra, kan formaldehyd tvärbindningar vändas genom kokning 9. Här är dessa två fördelar för att identifiera inte bara permanenta utan även övergående producentprisindex för membran proteins 6. I korthet är en Strep-markör fuserad till C-terminalen av den integralt membranbetesprotein. Celler som uttrycker membranbetesprotein inkuberas med formaldehyd som tvärbindningar bytesproteinerna till membranet betesprotein (figur 1). Behövs inte Modifieringar av bytesproteinerna. Därefter är det membranfraktionen förberedd. Därför är membranproteiner solubiliseras genom detergentbehandling och agn proteiner är samrenades med sitt byte proteiner med användning av affinitetsrening. Därefter tvärbinda omkastas genom kokning och betet och dess sam-eluerade bytesproteinerna separeras genom SDS-PAGE. Slutligen kan bytesproteinerna identifieras genom immunoblot-analys eller mass-spektrometri.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="878">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">37% Formaldehyde</td>
			<td style="width:128px;">Roth</td>
			<td style="width:137px;">4979.1</td>
			<td style="width:271px;">Should not be older than one year</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DNaseI</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">DN25</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">BCA protein assay kit</td>
			<td style="width:128px;">Pierce</td>
			<td style="width:137px;">23225</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Micromagnetic rod</td>
			<td style="width:128px;">Roth</td>
			<td style="width:137px;">0955.2</td>
			<td style="width:271px;">5 mm in length, 2 mm in diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:128px;">Roth</td>
			<td style="width:137px;">6683.1</td>
			<td style="width:271px;">standard detergent for solubilization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">n-Dodecyl-&#946;-maltoside</td>
			<td style="width:128px;">Glycon</td>
			<td style="width:137px;">D97002-C</td>
			<td style="width:271px;">the best detergent to solubilze CpxA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column</td>
			<td style="width:128px;">IBA</td>
			<td style="width:137px;">2-1207-050</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Strep-tag protein purification buffer set</td>
			<td style="width:128px;">IBA</td>
			<td style="width:137px;">2-1002-001</td>
			<td style="width:271px;">Contains buffer W and buffer E</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Amicon Ultra-4 centrifugal filter</td>
			<td style="width:128px;">Millipore</td>
			<td style="width:137px;">UFC803024</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate</td>
			<td style="width:128px;">Pierce</td>
			<td style="width:137px;">34080</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">SilverQuest Silverstaining kit</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">LC6070</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">FireSilver Staining Kit</td>
			<td style="width:128px;">Proteome Factory</td>
			<td style="width:137px;">P-S-2001</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

membrane-spine: a biochemical tool to identify protein-protein interactions of membrane proteins in vivo

Membranproteiner är viktiga för cellernas livskraft och är därför viktiga terapeutiska mål 1-3. Eftersom de fungerar i komplex 4, metoder för att identifiera och karaktärisera deras interaktioner är nödvändiga 5. Därför utvecklade vi den Membrane Strep-proteininteraktion experiment kallat Membran-SPINE 6. Denna teknik kombinerar in vivo tvärbindning med den reversibla tvärbindnings formaldehyd med affinitetsrening av en Strep-märkta membranbetesprotein. Under förfarandet tvärbundna bytesproteinerna är samrenades med membranet betesprotein och därefter separeras genom kokning. Därför kan två stora uppgifter att utföras vid analys av protein-proteininteraktioner (PPI) för membranproteiner med hjälp av Membran-SPINE: först, bekräftelse av en föreslagen interaktionspartner genom immun, och andra, att identifiera nya interaktionspartners genom masspektrometrianalys . Även low samhörighet, övergående protonpumpshämmare kan detekteras med denna teknik. Slutligen är Membran-SPINE kan anpassas till nästan alla celltyper, vilket gör det tillämpas som ett kraftfullt verktyg för screening för att identifiera PPI av membranproteiner.

Membran SPINE analys möjliggör samtidig rening av membranproteiner och transient samverkande proteinpartner. Samtidig rening uppnås genom att använda tvärbindningsmedlet formaldehyd. Två parametrar är avgörande för att förhindra ospecifika tvärbindningar: formaldehydkoncentrationen och den tvärbindningen tid. Det är tillräckligt, men inte överdriven användning av formaldehyd kan enkelt styras genom immunoblotting. Formaldehyd tvärbundna protein-komplex kan separeras genom kokning men ej med hjälp av SD...

Watch this Scientific Journal Video about Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo at JoVE.com

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Biokemisk tillvägagångssätt beskrivs för att identifiera in vivo-protein-proteininteraktioner (PPI) av membranproteiner. Metoden kombinerar proteintvärbindning, affinitetsrening och masspektrometri, och kan anpassas till nästan vilken celltyp eller organism. Med detta synsätt blir ännu identifiering av övergående PPI möjligt.

Membran-SPINE: A Biochemical verktyg för att identifiera protein-proteininteraktioner av membranproteiner<em&gt; In Vivo</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Tillverkning av elektrokemiska-DNA biosensorer för att Reagentless Upptäckt av nukleinsyror, proteiner och små molekyler

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Visualisera proteiner och Makromolekylär av negativa Stain EM: från Grid förberedelse till Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design av en cyklisk tryck Bioreaktor för Ex vivo Studie av Aorta hjärtklaffar

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Fastställande av transport Andel Xenobiotika och nanomaterial igenom moderkakan med<em&gt; Ex vivo</em&gt; Human placentaperfusionen Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Isolation and Characterization Of Chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow

Isolering och karakterisering av chimeriska mänskliga fc-uttrycka proteiner med protein A membran adsorbatorer och ett strömlinjeformat arbetsflöde

Laboratory scale to industrial scale purification of biomolecules from cell culture supernatants and lysed cell solutions can be accomplished using ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminiscens Resonance Energy Transfer att studera strukturförändringar i membranproteiner i däggdjursceller

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescens-släckning av en Liposomal-inkapslad Nära-infraröd fluoroforen som ett verktyg för<em&gt; In Vivo</em&gt; Optisk avbildning

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Sandwich liknande mikromiljöer att utnyttja Cell / Material Interaktioner

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Beredning av 3D koUagengeler och mikro för studien av 3D interaktioner<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

DNA nanorör som ett mångsidigt verktyg för att studera Semiflexible polymerer

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...