Name: confocal imaging of single mitochondrial superoxide flashes in intact heart or in vivo
Uploaded: 2013-11-05T19:00:00
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Les auteurs tiennent à remercier les Drs. Heping Cheng, Huiliang Zhang et Stephen Kolwicz pour leurs commentaires utiles et un soutien technique à l&#39;élaboration de cette méthode. Cette étude a été financée par des subventions du NIH et la subvention de développement scientifique de l&#39;American Heart Association à WW.

Une. Expérience Préparation <ol><li> Préparer la solution isotonique équilibrée de sel (50 ml) contenant: 140 mM de NaCl, 5 mM KCl, 2,5 mM de CaCl2, 2 mM de MgCl2 et 10 mM de HEPES (pH 7,2) pour l&#39;imagerie du muscle squelettique in vivo. </li><li> Préparer 1 L de tampon Krebs-Henseleit (KHB) contenant: 118 mM de NaCl, KCl 5,3, 1,2 mM MgSO 4, EDTA 0,5 mM et 25 mM NaHCO 3. </li><li> La bulle KHB avec un gaz contenant 95% d&#39;O 2/5% de CO2 pendan...

<ol>
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Cardiol. 50, 940-950 (2011).</li><li>Pasdois, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+diazoxide+on+flavoprotein+oxidation+and+reactive+oxygen+species+generation+during+ischemia-reperfusion:+a+study+on+Langendorff-perfused+rat+hearts+using+optic+fibers.">Effect of diazoxide on flavoprotein oxidation and reactive oxygen species generation during ischemia-reperfusion: a study on Langendorff-perfused rat hearts using optic fibers.</a> Am. J. Physiol. 294, H2088-H2097 (2008).</li><li>Granville, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+ischemia+and+reperfusion-induced+myocardial+damage+by+cytochrome+P450+inhibitors.">Reduction of ischemia and reperfusion-induced myocardial damage by cytochrome P450 inhibitors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 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Imagerie des événements mitochondriaux simples dans l&#39;animal vivant ou organes perfusés a avantage significatif par rapport aux méthodes traditionnelles pour évaluation de la fonction mitochondriale 17,19,21,22,24,25. La technique décrite ici peut obtenir en temps réel la détermination in situ de la fonction mitochondriale dans un véritable état ​​physiologique à la résolution subcellulaire dans. Ceci est particulièrement utile, lorsque combinés à d&#39;autres mesures,...

Les mitochondries jouent un rôle central dans la bioénergétique cellulaire, la signalisation des radicaux libres, homéostasie redox, la régulation ionique, et le destin des cellules détermination 1,2. le dysfonctionnement des mitochondries et accompagne souvent la base de la pathogenèse des maladies 6.3. En particulier dans les systèmes musculaires tels que le cœur et les muscles squelettiques, la respiration mitochondriale fournit la majorité de l&#39;ATP pour soutenir la réglementation en temps opportun de calcium intracellulaire et robuste 7,8 de développement des forces. Ces muscles possèdent un grand nombre de mitochondries qui occupent souvent jusqu&#39;à 20 à 40% du volume total de la pile et qui sont &quot;fixées&quot; entre deux myofilaments. Malgré de nombreuses études, notre compréhension de la régulation de la fonction mitochondriale, notamment in vivo et dans des conditions physiologiquement pertinents, est limitée. Une des raisons est que la majorité des méthodes développées pour évaluer la fonction mitochondriale forte dans vitro ou ex approches in vivo, tels que la surveillance de la consommation d&#39;oxygène des mitochondries isolées supplémentées avec des substrats artificiels, et la détermination indirecte de la fonction mitochondriale par l&#39;intermédiaire morphologie (microscopie par exemple électrons), l&#39;activité enzymatique (par exemple, l&#39;activité aconitase), ou les taux d&#39;ATP intracellulaire 11.9 . Récemment, de petites molécules fluorescentes indicateurs avec enrichissement mitochondrial rapport ont été appliquées à fournir un aperçu des signaux mitochondriaux, y compris le potentiel de membrane, de calcium et d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS), dans des cellules intactes 11-13. En outre, plusieurs protéine fluorescente verte (GFP) et les indicateurs redox à base de ROS ont été développés pour réaliser une évaluation plus précise de l&#39;redox intracellulaire ou compartimentée signaux ROS 14-16. Parmi cela, nous avons développé un indicateur codé génétiquement superoxyde, la protéine fluorescente jaune permuté circulaire, et Targeted dans les mitochondries (mt-cpYFP) 17. mt-cpYFP peut être excité à 405 ou 488 nm avec deux pics d&#39;émission à 515 nm. L&#39;émission à 488 nm excitation est particulièrement sensible à la superoxyde comme le montre précédente in vitro et in vivo étalonnages 17,18. L&#39;émission à 405 nm excitation est utilisé comme contrôle interne (s&#39;il vous plaît se référer à la figure 1 de la référence 17 pour des informations détaillées sur les spectres d&#39;émission et d&#39;excitation de mt-cpYFP dans diverses conditions). Avec time-lapse imagerie confocale, cet indicateur détecte l&#39;éclatement des événements de production de superoxyde dismutase, nommés clignote, dans les mitochondries de simples cellules intactes. Superoxyde éclair sert une fonction composite de la respiration mitochondriale, d&#39;accompagnement transitoire dépolarisation de la membrane mitochondriale et la production de ROS 17-20. Récemment, nous avons généré les pan-tissus mt-cpYFP souris transgéniques en utilisant le vecteur pUC-CAGGS-mt-cpYFP 17,19 sur C57/BL6 fond et vérifié les expres fortssion de cet indicateur dans le cœur, les muscles du squelette et d&#39;autres tissus (figure 2). Les souris transgéniques sera disponible pour des chercheurs universitaires intéressés sur demande et d&#39;approbation MTA par l&#39;Université de Washington. Dans cette étude, nous décrivons l&#39;imagerie in situ des superoxydes clignote dans Langendorff perfusé coeur ainsi que l&#39;imagerie in vivo des événements flash dans les muscles squelettiques de mt-cpYFP souris transgéniques anesthésiés 17,19 en. Cette technologie permet la surveillance en temps réel de simples événements mitochondriaux de production de ROS dans un état ​​physiologiquement pertinent ou in vivo 21,22. Il est également possible d&#39;utiliser le système pour surveiller d&#39;autres paramètres mitochondriaux simples tels que le potentiel de membrane et de calcium avec des indicateurs fluorescents appropriés. Évaluation plus, simultanément ou en parallèle de la fonction mitochondriale des événements intracellulaires (par exemple, les transitoires de calcium) ou la fonction cardiaque (par exemple,. Fraction d&#39;éjection) peut être obtenue. Perturbations pathologiques tels que l&#39;ischémie et de la reperfusion, peuvent être appliquées au cœur perfusé à évaluer l&#39;impact du stress sur la fonction mitochondriale unique dans le myocarde intact.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>B592500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC34961-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7006-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#8226;6H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#8226;7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1880-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8282-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2256-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Confocal Line Scanning Microscope (LSM 510 Meta, Zeiss), software version 4.2 SP1 including &#34;Physiological Analysis&#34; module.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal imaging of single mitochondrial superoxide flashes in intact heart or in vivo

Mitochondrie est un organite intracellulaire critique responsable de la production d&#39;énergie et la signalisation intracellulaire dans les systèmes eucaryotes. Dysfonction mitochondriale accompagne souvent et contribue à la maladie humaine. La majorité des approches qui ont été développées pour évaluer la fonction mitochondriale et le dysfonctionnement sont basées sur in vitro ou ex vivo mesures. Les résultats de ces expériences ont la capacité à déterminer la fonction mitochondriale in vivo est limitée. Ici, nous décrivons une nouvelle approche qui utilise la microscopie à balayage confocal pour l&#39;imagerie de tissus intacts en aminals vivants, ce qui permet l&#39;évaluation de la fonction mitochondriale unique d&#39;une manière en temps réel in vivo. Tout d&#39;abord, on génère des souris transgéniques exprimant la cible mitochondriale indicateur de superoxyde, la protéine fluorescente jaune circulairement permuté (mt-cpYFP). Mt-cpYFP anesthésiés souris est fixé sur un adaptateur de platine sur mesure et images de time-lapse sont prises felon les muscles squelettiques exposées de la patte arrière. La souris est ensuite sacrifiée et le coeur est mis en place pour la perfusion de Langendorff avec des solutions physiologiques à 37 ° C. Le cœur perfusé est placé dans une chambre spéciale sur la platine du microscope confocal et une légère pression est appliquée pour immobiliser le cœur et supprimer rythme cardiaque induite par l&#39;artefact de mouvement. Superoxydes sont détectés par les bouffées de 2D en temps réel imagerie confocale à une fréquence d&#39;une image par seconde. La solution de perfusion peut être modifié pour contenir des substrats différents de respiration ou d&#39;autres indicateurs fluorescents. La perfusion peut également être ajustée pour produire des modèles de maladies telles que l&#39;ischémie et la reperfusion. Cette technique est une approche unique pour déterminer la fonction de mitochondrie unique dans les tissus intacts et in vivo.

Selon ce protocole, l&#39;imagerie in vivo des événements mitochondriaux simples peut être fait dans les muscles squelettiques de souris anesthésiées suivie par imagerie in situ coeur perfusé (figure 1) en. Le réglage optimal des conditions d&#39;imagerie permettra d&#39;assurer des images claires des tissus musculaires intactes et à la résolution de mitochondrie unique (figure 2). TMRM est souvent utilisé pour vérifier l&#39;emplacement du mt-cpYFP...

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Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Microscopie confocale à balayage est appliqué pour l&#39;imagerie des événements mitochondriaux simples dans le cœur perfusé ou les muscles squelettiques dans les animaux vivants. Surveillance en temps réel des processus mitochondriaux simples tels que les bouffées de superoxydes et les fluctuations potentielles membrane permet l&#39;évaluation de la fonction mitochondriale dans un contexte physiologiquement pertinente et pendant perturbations pathologiques.

Imagerie confocale de simples mitochondriales superoxyde Flashs à coeur Intact ou<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Research

JoVE Journal

Biology

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

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