Name: confocal imaging of single mitochondrial superoxide flashes in intact heart or in vivo
Uploaded: 2013-11-05T19:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo at JoVE.com

Os autores gostariam de agradecer as Dras. Heping Cheng, Huiliang Zhang e Stephen Kolwicz por seus comentários e apoio técnico no desenvolvimento deste método. Este estudo foi suportado por concessões do NIH e da Scientist Desenvolvimento Grant da American Heart Association para WW.

1. Experiência Preparação <ol><li> Preparar a solução isotónica salina equilibrada (50 ml) contendo: 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2,5 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2 e 10 mM de HEPES (pH 7,2) para a visualização in vivo do músculo esquelético. </li><li> Prepare 1 litro de tampão de Krebs-Henseleit (KHB) contendo: NaCl 118 mM, KCl 5,3 mM, MgSO4 1,2 mM, EDTA 0,5 mM e 25 mM de NaHCO3. </li><li> Bolha KHB com gás contendo 95% de O2 / 5% de CO 2 ...

<ol>
	<li>Brookes, P. S., Yoon, Y., Robotham, J. L., Anders, M. W., Calcium Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium,+ATP,+and+ROS:+a+mitochondrial+love-hate+triangle.">Calcium, ATP, and ROS: a mitochondrial love-hate triangle.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, 817-833 (2004).</li><li>Scheffler, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitochondria. , (2008).</li><li>Rosca, M. G., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+heart+failure.">Mitochondria in heart failure.</a> Cardiovasc. Res. 88, 40-50 (2010).</li><li>Griffiths, E. 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Cardiol. 50, 940-950 (2011).</li><li>Pasdois, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+diazoxide+on+flavoprotein+oxidation+and+reactive+oxygen+species+generation+during+ischemia-reperfusion:+a+study+on+Langendorff-perfused+rat+hearts+using+optic+fibers.">Effect of diazoxide on flavoprotein oxidation and reactive oxygen species generation during ischemia-reperfusion: a study on Langendorff-perfused rat hearts using optic fibers.</a> Am. J. Physiol. 294, H2088-H2097 (2008).</li><li>Granville, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+ischemia+and+reperfusion-induced+myocardial+damage+by+cytochrome+P450+inhibitors.">Reduction of ischemia and reperfusion-induced myocardial damage by cytochrome P450 inhibitors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 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Imagiologia eventos mitocondriais individuais em animal vivo ou órgãos perfundidos tem vantagem significativa em relação aos métodos tradicionais de avaliação da função mitocondrial 17,19,21,22,24,25. A técnica aqui descrita pode realizar em tempo real a determinação in situ da função mitocondrial em condições fisiológicas reais na resolução subcelular. Isto é particularmente útil, quando combinada com outras medidas, para estudar sistematicamente o papel da mitocôndria...

As mitocôndrias têm um papel central na bioenergética celular, sinalização de radicais livres, homeostase redox, regulação iônica e determinação do destino da célula 1,2. As mitocôndrias disfunção muitas vezes acompanha e sustenta a patogênese de doenças 3-6. Especialmente nos sistemas musculares, tais como o coração e músculos esqueléticos, respiração mitocondrial fornece a maior parte do ATP para apoiar a regulação atempada de cálcio intracelular e robusto 7,8 desenvolvimento de força. Estes músculos possuem um grande número de mitocôndrias, que muitas vezes ocupam até 20-40% do volume total de células e são &quot;fixos&quot; entre miofilamentos 2. Apesar de numerosos estudos, a nossa compreensão da regulação da função mitocondrial, especificamente in vivo e em condições fisiologicamente relevantes, é limitado. Uma das razões é que a maioria dos métodos desenvolvidos para avaliar a função mitocondrial confiar em VITRo ou ex vivo abordagens, tais como monitoramento do consumo de oxigênio de mitocôndrias isoladas suplementadas com substratos artificiais, ea determinação indireta da função mitocondrial através da morfologia (microscopia de elétrons, por exemplo), a atividade da enzima (por exemplo, atividade aconitase), ou os níveis de ATP intracelular 9-11 . Recentemente, pequenos indicadores fluorescentes molécula com enriquecimento relativo mitocondrial têm sido aplicados para fornecer um vislumbre dos sinais mitocondriais, incluindo o potencial de membrana, cálcio e espécies reativas de oxigênio (ROS), em células intactas 11-13. Além disso, vários de proteína fluorescente verde (GFP) e indicadores redox baseado ROS foram desenvolvidos para obter uma avaliação mais específica do redox intracelular compartimentada ou ROS sinaliza 14-16. Entre isto, foi desenvolvido um indicador geneticamente codificado superóxido, a proteína fluorescente amarela permutada circular, e targeted-lo para dentro da mitocôndria (mt-cpYFP) 17. mt-cpYFP pode ser excitado a 405 ou 488 nm, com dois picos de emissão de 515 nm. A emissão a 488 nm de excitação é especificamente responsivo a superóxido como mostrado pela anterior in vitro e in vivo calibrações 17,18. A emissão a 405 nm de excitação é utilizado como controle interno (consulte a Figura 1 da Ref. 17 para obter informações detalhadas sobre os espectros de emissão e excitação de mt-cpYFP sob várias condições). Com time-lapse confocal de imagem, este indicador detecta estourando eventos produção de superóxido dismutase, nomeado flashes, em mitocôndrias isolados de células intactas. Flash Superoxide serve como uma função composta de respiração mitocondrial, a despolarização da membrana mitocondrial transitória acompanhamento e produção de ROS 17-20. Recentemente, gerou os pan-tecido mt-cpYFP camundongos transgênicos usando o vector pUC-CAGGS-mt-cpYFP 17,19 em C57/BL6 fundo e verificar as expressões fortesção deste indicador no coração, músculos esqueléticos e outros tecidos (Figura 2). Os camundongos transgênicos estarão disponíveis para os investigadores acadêmicos interessados ​​mediante solicitação e aprovação MTA pela Universidade de Washington. Neste estudo, descrevemos em imagem in situ de superóxido flashes em Langendorff coração perfundido, bem como in vivo de imagens de eventos de flash em músculos esqueléticos de camundongos transgênicos mt-cpYFP anestesiados 17,19. Esta tecnologia permite o monitoramento em tempo real de eventos de produção ROS único mitocondrial em uma condição fisiologicamente relevante ou in vivo 21,22. Também é possível usar o sistema para controlar outros parâmetros individuais mitocondriais, tais como o potencial de membrana e de cálcio com indicadores fluorescentes adequadas. Avaliação Além disso, simultânea ou paralela da função mitocondrial com eventos intracelulares (por exemplo, transientes de cálcio) ou de função cardíaca (por exemplo,. Fração de ejeção) pode ser alcançado. Perturbações patológicas, tais como a isquemia e reperfusão, pode ser aplicada ao coração perfundido para avaliar o impacto do stress sobre a função mitocondrial único no miocárdio intacta.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>B592500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC34961-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7006-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#8226;6H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#8226;7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1880-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8282-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2256-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Confocal Line Scanning Microscope (LSM 510 Meta, Zeiss), software version 4.2 SP1 including &#34;Physiological Analysis&#34; module.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal imaging of single mitochondrial superoxide flashes in intact heart or in vivo

Mitocôndria é uma organela intracelular crítico responsável pela produção de energia e de sinalização intracelular em sistemas eucariotas. Disfunção mitocondrial, muitas vezes acompanha e contribui para a doença humana. Maioria das abordagens que têm sido desenvolvidas para avaliar a função mitocondrial e disfunção são baseados na produção in vitro ou ex vivo, as medições. Os resultados desses experimentos têm capacidade para determinar a função mitocondrial in vivo limitado. Aqui, descrevemos uma nova abordagem que utiliza microscopia confocal para a imagem de tecidos intactos em aminals ao vivo, o que permite a avaliação da função mitocondrial único de uma forma em tempo real in vivo. Em primeiro lugar, gerar camundongos transgênicos expressando o indicador de superóxido mitocondrial alvo, a proteína fluorescente amarela permuta circular (mt-cpYFP). Mt-cpYFP anestesiados mouse é fixo em um adaptador de estágio feito por encomenda e as imagens de lapso de tempo são tomadas from os músculos esqueléticos expostas do membro posterior. O mouse é posteriormente sacrificado eo coração está configurado para Langendorff perfusão com soluções fisiológicas a 37 ° C. O coração perfundido está posicionado em uma câmara especial no palco microscópio confocal e uma leve pressão é aplicada para imobilizar o coração e suprimir batimento cardíaco artefato movimento induzido. Superóxido flashes são detectados pelo tempo real de imagens 2D confocal com uma frequência de um quadro por segundo. A solução de perfusão podem ser modificadas para conter diferentes substratos de respiração ou outros indicadores fluorescentes. A perfusão pode também ser ajustado para produzir modelos de doenças tais como a isquemia e reperfusão. Esta técnica é uma abordagem única para a determinação da função de simples mitocôndria em tecidos intactos e in vivo.

De acordo com este protocolo, imagem in vivo de eventos mitocondriais único pode ser feito em músculos esqueléticos de ratos anestesiados, seguido por em imagem situ no coração perfusão (Figura 1). A configuração ideal das condições de imagem garante imagens nítidas dos tecidos musculares intactas e com resolução mitocôndria única (Figura 2). TMRM é muitas vezes usado para verificar a localização de mt-cpYFP e deve apresentar um padrão de so...

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Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Microscopia confocal é aplicada para imagens individuais em eventos mitocondriais coração perfundido ou músculos esqueléticos em animal vivo. Monitoramento em tempo real de processos mitocondriais único, como superóxido flashes e membrana possíveis flutuações permite a avaliação da função mitocondrial em um contexto fisiologicamente relevante e durante perturbações patológicas.

Imagem confocal de Solteiro mitocondriais superóxido Pisca em coração intacto ou<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Research

JoVE Journal

Biology

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

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Eletroporação única célula in vivo dentro do cérebro intacto desenvolvimento

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