Name: confocal imaging of single mitochondrial superoxide flashes in intact heart or in vivo
Uploaded: 2013-11-05T19:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo at JoVE.com

Yazarlar Dr teşekkür etmek istiyorum. Heping Cheng, onların yararlı yorumlarından ve bu yöntemi geliştirerek teknik destek için Huiliang Zhang ve Stephen Kolwicz. Bu çalışma NIH hibe ve Amerikan Kalp Derneği WW Scientist Kalkınma Grant tarafından desteklenmiştir.

1.. Deney Hazırlama <ol><li> 140 mM NaCI, 5 mM KCI, 2.5 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, in vivo görüntüleme için iskelet kası (pH 7.2) ihtiva eden izotonik bir dengelenmiş tuz çözeltisi (50 ml) hazırlayın. </li><li> 118 mM NaCI, 5.3 mM KCI, 1.2 mM MgSO 4, 0.5 mM EDTA ve 25 mM NaHCO 3: içeren Krebs-Henseleit tamponu (KHB) 1 L hazırlayın. </li><li> Kabarcık gaz ihtiva eden% 95 O 5/2 önceden 2 mM CaCl2 eklenmesinden 10-15 dakika...

<ol>
	<li>Brookes, P. S., Yoon, Y., Robotham, J. L., Anders, M. W., Calcium Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium,+ATP,+and+ROS:+a+mitochondrial+love-hate+triangle.">Calcium, ATP, and ROS: a mitochondrial love-hate triangle.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, 817-833 (2004).</li><li>Scheffler, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitochondria. , (2008).</li><li>Rosca, M. G., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+heart+failure.">Mitochondria in heart failure.</a> Cardiovasc. Res. 88, 40-50 (2010).</li><li>Griffiths, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+heart+disease.">Mitochondria and heart disease.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 942, 249-267 (2012).</li><li>Winklhofer, K. F., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease.">Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).</li><li>Pieczenik, S. R., Neustadt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+molecular+pathways+of+disease.">Mitochondrial dysfunction and molecular pathways of disease.</a> Exp. Mol. Pathol. 83, 84-92 (2007).</li><li>Szentesi, P., Zaremba, R., van Mechelen, W., Stienen, G. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+utilization+for+calcium+uptake+and+force+production+in+different+types+of+human+skeletal+muscle+fibres.">ATP utilization for calcium uptake and force production in different types of human skeletal muscle fibres.</a> J. Physiol. 531, 393-403 (2001).</li><li>Lemieux, H., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+the+human+heart.">Mitochondria in the human heart.</a> J. Bioenerg. Biomembr. 41, 99-106 (2009).</li><li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+enzymes+in+oxidative+phosphorylation.+III.+The+steady+state.">Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state.</a> J. Biol. Chem. 217, 409-427 (1955).</li><li>Lambert, A. J., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+production+by+mitochondria.">Reactive oxygen species production by mitochondria.</a> Methods Mol Biol. 554, 165-181 (2009).</li><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem. J. 435, 297-312 (2011).</li><li>Robinson, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+fluorescent+imaging+of+superoxide+in+vivo+using+ethidium-based+probes.">Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15038-15043 (2006).</li><li>Dickinson, B. C., Srikun, D., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial-targeted+fluorescent+probes+for+reactive+oxygen+species.">Mitochondrial-targeted fluorescent probes for reactive oxygen species.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 14, 50-56 (2010).</li><li>Dooley, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators.">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279, 22284-22293 (2004).</li><li>Hanson, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitochondrial+redox+potential+with+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+indicators.">Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279, 13044-13053 (2004).</li><li>Belousov, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+fluorescent+indicator+for+intracellular+hydrogen+peroxide.">Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide.</a> Nat. Methods. 3, 281-286 (2006).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+Flashes+in+Single+Mitochondria.">Superoxide Flashes in Single Mitochondria.</a> Cell. 134, 279-290 (2008).</li><li>Wei-Lapierre, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respective+Contribution+of+Mitochondrial+Superoxide+and+pH+to+Mitochondria-targeted+Circularly+Permuted+Yellow+Fluorescent+Protein+(mt-cpYFP)+Flash+Activity.">Respective Contribution of Mitochondrial Superoxide and pH to Mitochondria-targeted Circularly Permuted Yellow Fluorescent Protein (mt-cpYFP) Flash Activity.</a> J. Biol. Chem. 288, 10567-10577 (2013).</li><li>Fang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+superoxide+flash+and+metabolism-coupled+mitochondrial+permeability+transition+in+living+animals.">Imaging superoxide flash and metabolism-coupled mitochondrial permeability transition in living animals.</a> Cell Res. 21, 1295-1304 (2011).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+superoxide+flashes:+metabolic+biomarkers+of+skeletal+muscle+activity+and+disease.">Mitochondrial superoxide flashes: metabolic biomarkers of skeletal muscle activity and disease.</a> FASEB J. 25, 3068-3078 (2011).</li><li>Sheu, S. S., Wang, W., Cheng, H., Dirksen, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+flashes:+illuminating+new+insights+into+cardiac+ischemia/reperfusion+injury.">Superoxide flashes: illuminating new insights into cardiac ischemia/reperfusion injury.</a> Future Cardiol. 4, 551-554 (2008).</li><li>Wei, L., Dirksen, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on:+SGP+symposium+on+mitochondrial+physiology+and+medicine:+mitochondrial+superoxide+flashes:+from+discovery+to+new+controversies.">Perspectives on: SGP symposium on mitochondrial physiology and medicine: mitochondrial superoxide flashes: from discovery to new controversies.</a> J. Gen. Physiol. 139, 425-434 (2012).</li><li>Johnson, I., Spence, M. T. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+12.2.">Ch. 12.2.</a> The Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , 510-511 (2013).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+flashes:+elemental+events+of+mitochondrial+ROS+signaling+in+the+heart.">Superoxide flashes: elemental events of mitochondrial ROS signaling in the heart.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 52, 940-948 (2012).</li><li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+flashes+reveal+novel+properties+of+mitochondrial+reactive+oxygen+species+excitability+in+cardiomyocytes.">Superoxide flashes reveal novel properties of mitochondrial reactive oxygen species excitability in cardiomyocytes.</a> Biophys. J. 102, 1011-1021 (2012).</li><li>Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+heart+perfusion:+The+Langendorff+technique+of+isolated+heart+perfusion.">Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 50, 940-950 (2011).</li><li>Pasdois, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+diazoxide+on+flavoprotein+oxidation+and+reactive+oxygen+species+generation+during+ischemia-reperfusion:+a+study+on+Langendorff-perfused+rat+hearts+using+optic+fibers.">Effect of diazoxide on flavoprotein oxidation and reactive oxygen species generation during ischemia-reperfusion: a study on Langendorff-perfused rat hearts using optic fibers.</a> Am. J. Physiol. 294, H2088-H2097 (2008).</li><li>Granville, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+ischemia+and+reperfusion-induced+myocardial+damage+by+cytochrome+P450+inhibitors.">Reduction of ischemia and reperfusion-induced myocardial damage by cytochrome P450 inhibitors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1321-1326 (2004).</li><li>Davidson, S. M., Yellon, D. M., Murphy, M. P., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+calcium+waves+and+redox+changes+precede+mitochondrial+permeability+transition+pore+opening+in+the+intact+heart+during+hypoxia+and+reoxygenation.">Slow calcium waves and redox changes precede mitochondrial permeability transition pore opening in the intact heart during hypoxia and reoxygenation.</a> Cardiovasc. Res. 93, 445-453 (2012).</li></ol>

Canlı hayvan veya perfüze organ tek mitokondriyal olayları görüntüleme mitokondrial fonksiyon değerlendirme 17,19,21,22,24,25 için geleneksel yöntemlere göre önemli bir avantaja sahiptir. Burada anlatılan teknik, hücre içi çözünürlükte gerçek bir fizyolojik duruma mitokondriyal fonksiyon in situ tespiti gerçek zaman elde edilebilir. Sistemik olarak, in vivo olarak belirli bir organ veya hücre tipinde normal fonksiyonu, mitokondri rolünü incelemek için, diğe...

Mitokondri hücre Bioenerji merkezi rol, serbest radikal sinyalizasyon, redoks hemostazını, iyon düzenlenmesi ve hücre kaderinin belirlenmesi 1,2 oynamaktadır. Mitokondri disfonksiyon sıklıkla eşlik eder ve hastalık 3-6 patogenezi yatmaktadır. Özellikle bu kalp ve iskelet kasları gibi kas sistemlerinde, mitokondriyal solunum hücre içi kalsiyum ve sağlam, güç geliştirme 7,8 zamanında düzenleme desteklemek için ATP çoğunluğu içerir. Bu kaslar, genellikle, toplam hücre hacmi% 20-40 kadar işgal myofilaments 2 arasında &quot;sabit&quot; olan mitokondri içinde çok sayıda sahiptirler. Çok sayıda araştırmaya rağmen, özellikle in vivo ve fizyolojik ilgili koşullar altında mitokondriyal fonksiyon yönetmelik, anlayışımız, sınırlıdır. Bunun nedenlerinden biri, mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmek için geliştirilmiş yöntemlerin çoğunluğu vitr olarak itimato ya da eski tür yapay substratlar ile takviye izole mitokondri oksijen tüketimi ve morfoloji yoluyla mitokondriyal fonksiyonun belirlenmesi dolaylı (örneğin elektron mikroskopisi), enzim aktivitesi (örneğin akonitaz aktivite) ya da hücre içi ATP seviyeleri 9-11 izlenmesi gibi vivo yaklaşımlar, . Son zamanlarda, göreceli mitokondriyal zenginleştirme ile küçük molekül floresan göstergeler sağlam hücrelerde zar potansiyeli, kalsiyum ve reaktif oksijen türlerinin (ROS), dahil olmak üzere 11-13 mitokondriyal sinyallerin bir belirti sağlamak için uygulanmıştır. Ayrıca, çok sayıda yeşil floresan protein (GFP) redoks bazlı ve ROS göstergeleri bölümlere hücre içi redoks veya ROS 14-16 sinyal daha özel bir değerlendirme elde etmek için geliştirilmiştir. Bu arasında, bir genetik olarak kodlanmış süperoksit göstergesi, dairesel sırası değiştirilmiş sarı floresan protein ve targete gelişmişmitokondri (mt-cpYFP) 17 içine d o. mt-cpYFP 515 nm &#39;de iki emisyon tepe ile 405 ya da 488 nm&#39;de uyarıldığında edilebilir. 488 nm eksitasyon emisyon in vitro ve in vivo kalibrasyon 17,18 önceki ile gösterildiği gibi, süperoksit özellikle duyarlıdır. 405 nm uyarma emisyon (çeşitli koşullar altında mt-cpYFP emisyon ve uyarma spektrumları hakkında detaylı bilgi için Ref 17 Şekil 1&#39;e bakınız), iç kontrol olarak kullanılmıştır. Time-lapse konfokal görüntüleme ile bu gösterge sağlam hücreler tek mitokondrilerinde süperoksit yanıp adlı süperoksit üretimi olayları, patlama algılar. Süperoksit flaş mitokondrial solunum, ekli geçici mitokondriyal membran depolarizasyon ve ROS üretiminin 17-20 bir bileşik fonksiyonu olarak hizmet vermektedir. Son zamanlarda, biz pUC&#39;den CAGGS-mt-cpYFP vektör C57/BL6 arka planda 17,19 kullanarak pan-doku mt-cpYFP transgenik fareler üretilen ve güçlü Expres doğruladıktankalp, iskelet kasları ve diğer dokularda (Şekil 2) Bu göstergenin sion. Transgenik fareler istek ve Washington Üniversitesi tarafından MTA onayıyla ilgilenen akademik araştırmacılar için geçerli olacak. Bu çalışmada, in situ Langendorff perfüze kalp süperoksit basmaları görüntüleme gibi anestezi uygulanmış mt-cpYFP transgenik farelerin 17,19 iskelet kaslarında flaş etkinlikleri in vivo görüntüleme açıklar. Bu teknoloji fizyolojik ilgili bir durum veya in vivo 21,22 tek mitokondriyal ROS üretim olayları gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak verir. Böyle uygun floresan gösterge ile membran potansiyeli ve kalsiyum gibi diğer tek mitokondriyal parametrelerini izlemek için sistemi kullanmak da mümkündür. Hücre içi olaylar (örn. kalsiyum geçici) veya kalp fonksiyonu (mitokondriyal fonksiyonu daha fazla, aynı anda ya da paralel değerlendirme örn.. Ejeksiyon fraksiyonu) elde edilebilir. Böyle iskemi reperfüzyon gibi patolojik tedirginlikler, sağlam miyokardiyumda tek mitokondriyal fonksiyonu üzerindeki stresin etkisini değerlendirmek için perfüze kalp uygulanabilir.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>B592500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC34961-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7006-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#8226;6H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#8226;7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1880-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8282-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2256-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Confocal Line Scanning Microscope (LSM 510 Meta, Zeiss), software version 4.2 SP1 including &#34;Physiological Analysis&#34; module.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal imaging of single mitochondrial superoxide flashes in intact heart or in vivo

Mitokondri ökaryotik sistemlerde enerji üretimi ve hücre içi sinyal sorumlu kritik bir hücre içi organel. Mitokondriyal işlev bozukluğu, genellikle eşlik eden ve insan hastalığına neden olur. Mitokondriyal işlev bozukluğu ve değerlendirmek için geliştirilmiştir yaklaşımlar çoğunluğu in vitro ya da ex vivo ölçümler dayanmaktadır. Bu deneylerden elde edilen sonuçlar, in vivo olarak mitokondriyal fonksiyonu belirlenmesinde yeteneği sınırlıdır. Burada, in vivo olarak, gerçek zamanlı bir şekilde, tek bir mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesine olanak tanır, canlı aminaller sağlam dokuların görüntülenmesi için, konfokal tarama mikroskobu kullanan yeni bir yaklaşımı tarif eder. İlk olarak, mitokondriyal hedeflenen süperoksit göstergesi, dairesel sırası değiştirilmiş sarı floresan proteini (mt-cpYFP) ifade eden transjenik fareler üretir. Anestezi mt-cpYFP fare ısmarlama bir sahne adaptörü ve zaman atlamalı görüntüler f alınır sabittirhindlimb açıkta kalan iskelet kasları rom. Fare daha sonra kurban edilir ve kalp 37 ° C&#39;de fizyolojik çözümleri ile Langendorff perfüzyon için ayarlanmış Perfüze kalp konfokal mikroskop sahnede özel bir odasında konumlandırılmış ve hafif basınç kalp hareketsiz ve kalp atışını kaynaklı hareket yapaylığı bastırmak için uygulanır. Süperoksit yanıp saniyede bir çerçeve frekansında gerçek zamanlı 2D konfokal görüntüleme ile tespit edilir. Perfüzyon çözüm farklı alt tabakaların solunum ya da diğer floresan göstergeleri ihtiva edecek şekilde modifiye edilebilir. Perfüzyon, aynı zamanda, iskemi ve reperfüzyon gibi hastalık modeller üretmek için ayarlanabilir. Bu teknik, sağlam dokularda ve in vivo olarak bir mitokondri fonksiyonunu belirlemek için benzersiz bir yaklaşımdır.

Bu protokole göre, tek mitokondriyal olayların in vivo görüntüleme anestezi farelerin iskelet kaslarında yapılabilir perfüze kalp yerinde görüntüleme (Şekil 1) izledi. Görüntüleme koşulları optimum ayarı bozulmamış kas dokularının net görüntüler sağlamak ve tek mitokondri çözünürlük (Şekil 2) ile olacaktır. TMRM genellikle mt-cpYFP konumunu kontrol etmek için kullanılır ve mt-cpYFP sinyali ile tam bir üst üste desen <stron...

Watch this Scientific Journal Video about Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo at JoVE.com

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Konfokal mikroskopi taraması, canlı bir hayvanda perfüze kalp ya da iskelet kaslarında bir mitokondriyal etkinlik görüntülenmesi için uygulanır. Süperoksit basması ve membran potansiyel dalgalanmalar gibi tek mitokondriyal süreçlerinin gerçek zamanlı izleme fizyolojik ilgili bir bağlamda ve patolojik tedirginlikler sırasında mitokondrial fonksiyon değerlendirilmesini sağlar.

Tek Mitokondriyal süperoksit Bozulmamış Kalp Flaşlar veya konfokal Görüntüleme<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Research

JoVE Journal

Biology

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Tek Hücre Elektroporasyon bozulmamış Gelişmekte olan beyin içindeki in vivo

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Tek hücreli fare Koni fotoreseptörlerin Emiş Kayıtlar

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Alt hücresel Çözünürlük bozulmamış Drosophila Larva in vivo Görüntüleme

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Kalsiyum değerlendirilmesi Bozulmamış İskelet kas liflerinin içinde Sparks

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Bozulmamış Arterlerin endotel katmanı Nitrik Oksit ve Süperoksit En Yüz Algılama

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

Yüksek çözünürlüklü Solunum permeabilize ve bozulmamış Hücreleri Mitokondrial fonksiyonu değerlendirmek için

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Drosophila Hazırlama ve Optik Koherens Mikroskobu Kullanımı In Vivo Kalp Fonksiyonu Boyuna Görüntüleme (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...

Confocal Imaging of Neuropeptide Y-pHluorin: A Technique to Visualize Insulin Granule Exocytosis in Intact Murine and Human Islets

Confocal peptit Y-pHluorin, görüntüleme: insülin granül ekzositozu olduğu gibi fare ve insan adacıkları görselleştirmek için bir teknik

Insulin secretion plays a central role in glucose homeostasis under normal physiological conditions as well as in disease. Current approaches to study ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Bozulmamış Organoidlerin Tek Hücreli Çözünürlükte Üç Boyutlu Görüntülemesi

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels

Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells

Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells (Video) | JoVE 

HeLa hücrelerinde canlı görüntüleme kullanılarak mitokondriyal membran potansiyelinin ve süperoksit seviyelerinin floresan bazlı ölçümü

Mitochondria are dynamic organelles critical for metabolic homeostasis by controlling energy production via ATP synthesis. To support cellular metabolism, ...