Name: slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells
Uploaded: 2014-01-10T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells at JoVE.com

أشكر جيني ت. لي على الإشراف على هذا المشروع عندما كنت في مختبر لي وتايلر برويرينغ لتحرير المخطوطة. وقد تم دعم هذا العمل من قبل جائزة الباحث باسل أوكونور كاتب من مسيرة مؤسسة الدايمات ومنحة المعاهد القومية للصحة GM098605.

1.3D إعداد الشرائح
<ol><li>إعداد الكواشف التالية:<ol>
<li>CSK العازلة: 100 mM NaCl, 300 mM السكروز, 10 م م أنابيب, 3 م م م2. ضبط درجة الحموضة إلى 6.8 مع 1 M NaOH. تخزين المخزن المؤقت CSK عند 4 °C.</li>
		<li>CSK العازلة مع 0.5٪ تريتون X-100: إضافة 200 ميكرولتر من تريتون X-100 إلى 40 مل من المخزن المؤقت CSK. امزج المحلول باستخدام الستي?...

<ol>
	<li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline.">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li><li>Namekawa, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmeiotic+sex+chromatin+in+the+male+germline+of+mice.">Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice.</a> Curr Biol. 16, 660-667 (2006).</li><li>Namekawa, S. H., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+nascent+RNA,+single-copy+DNA+and+protein+localization+by+immunoFISH+in+mouse+germ+cells+and+preimplantation+embryos.">Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos.</a> Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).</li><li>Mahadevaiah, S. K., Costa, Y., Turner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+RNA+FISH+to+study+gene+expression+during+mammalian+meiosis.">Using RNA FISH to study gene expression during mammalian meiosis.</a> Methods in molecular biology. 558, 433-444 (2009).</li><li>Hall, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ectopic+human+XIST+gene+can+induce+chromosome+inactivation+in+postdifferentiation+human+HT-1080+cells.">An ectopic human XIST gene can induce chromosome inactivation in postdifferentiation human HT-1080 cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 8677-8682 (2002).</li><li>Huynh, K. D., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+a+pre-inactivated+paternal+X+chromosome+in+early+mouse+embryos.">Inheritance of a pre-inactivated paternal X chromosome in early mouse embryos.</a> Nature. 426, 857-862 (2003).</li><li>Namekawa, S. H., VandeBerg, J. L., McCarrey, J. R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+chromosome+silencing+in+the+marsupial+male+germ+line.">Sex chromosome silencing in the marsupial male germ line.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9730-9735 (2007).</li><li>Namekawa, S. H., Payer, B., Huynh, K. D., Jaenisch, R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+imprinted+X+inactivation:+repeat+versus+genic+silencing+in+the+mouse.">Two-step imprinted X inactivation: repeat versus genic silencing in the mouse.</a> Mol Cell Biol. 30, 3187-3205 (2010).</li><li>Ichijima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MDC1+directs+chromosome-wide+silencing+of+the+sex+chromosomes+in+male+germ+cells.">MDC1 directs chromosome-wide silencing of the sex chromosomes in male germ cells.</a> Genes Dev. 25, 959-971 (2011).</li><li>Sin, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF8+regulates+active+epigenetic+modifications+and+escape+gene+activation+from+inactive+sex+chromosomes+in+post-meiotic+spermatids.">RNF8 regulates active epigenetic modifications and escape gene activation from inactive sex chromosomes in post-meiotic spermatids.</a> Genes Dev. 26, 2737-2748 (2012).</li></ol>

في إعداد الشرائح ثلاثية الأبعاد، تسبق خطوة permeabilization خطوة التثبيت. يتم تنفيذ هذه الخطوات مباشرة على الأنابيب شبهiferous، وبالتالي الحفاظ على بنية الكروماتين ثلاثي الأبعاد. خيار بديل للحفاظ على بنية الكروماتين لسمك الحمض النووي الريبي / الحمض النووي هو تنفيذ خطوة permeabilization وخطوة التثبيت في وق?...

في الخصية، الخلايا الجرثومية تفرق من الحيوانات المنوية ثنائية الفصيلة من خلال الميوس إلى ناضجة، الحيوانات المنوية haploid. خلال هذه العملية، يتم تشكيل هيكل الكروماتين النووي للخلايا الجرثومية بشكل مستمر وديناميكي. ينتشر السطح عادة ما تستخدم للفحص الخلوي للخلايا المنوية الفردية. وهناك طريقة سائدة من ينتشر السطح يستخدم العلاج hypotonic التي تنتشر الخلايا المنوية الفردية وسويت1. هذه الشروط هي الأمثل للتحليل التفصيلي للكروموسومات المريوتيكية. الميزات الكروموسومية مثل حالة متشابك و بؤر إعادة التركيب يمكن ملاحظتها بسهولة باستخدام هذه الطريقة. ومع ذلك ، فإن العلاج تحت الحجري يعطل بنية الكروماتين دون النووية ، وبالتالي فإن هذه التقنية ليست مناسبة للتحليل الهيكلي للنوى. وبالتالي، تم تصميم طريقة محسنة للحفاظ على بنية الكروماتين ثلاثية الأبعاد للخلايا الجرثومية الخصية. وقد وصفت هذه الطريقة بأنها طريقة الشريحة ثلاثية الأبعاد (3D)(الشكل 1). وقد مكنت طريقة الشريحة 3D الكشف عن توطين الحمض النووي الريبي الوليدة في النوى لأنه تم الأمثل في البداية لفحص التعبير الجيني وحالات الكروماتين خلال تمايز الخلايا الجرثومية الخصية من قبل RNA مضان في التهجين الموقعي (FISH)2,3. هذه الطريقة ثلاثية الأبعاد تنطبق أيضا على الجمع بين الفلورة المناعية والحمض النووي والأسماك الحمض النووي الريبي. بالإضافة إلى ذلك ، ساعدت هذه الطريقة في اكتشاف كروماتين الجنس بعد ميوتيك (PMSC) ، وهي مقصورة صامتة من الكروموسومات الجنسية الموجودة في الحيوانات المنوية بعد ميوتيك2.
تم تحسين طريقة الشريحة ثلاثية الأبعاد في الأصل من خلال الجمع بين خطوتين أساسيتين لإعداد الشرائح المستخدمة عادة للتلطيخ النووي: خطوة التثبيت المصممة لإصلاح المواد النووية وخطوة الثبات التي تهدف إلى إزالة المواد السيتوبلازمية من أجل تحسين إمكانية الوصول إلى الكواشف التلطيخية ، مثل الأجسام المضادة ومسابير FISH. كما سبق وصفه في منشور آخر 3 ، فقد تقرر أن خطوة permeabilization يجب أن تسبق خطوة التثبيت من أجلالحصولعلى أفضل النتائج مع خلفية السيتوبلازمية منخفضة. في طريقة الشريحة ثلاثية الأبعاد هذه ، يتم تنفيذ خطوة permeabilization وخطوة التثبيت اللاحقة مباشرة على الأنابيب شبهiferous ويتبعها الانفصال الميكانيكي للخلايا الجرثومية مع ملقط قبل السيتوسبينينغ على الشرائح. تم تطوير طريقة بديلة لأسماك الحمض النووي الريبي من الخلايا المنوية في مختبر آخر4. في هذا الأسلوب، بما يتفق مع الأسلوب 3D، يجب أن تسبق خطوة permeabilization خطوة التثبيت من أجل الحصول على أفضل النتائج من RNA FISH.
يصف البروتوكول التالي طريقة الشريحة ثلاثية الأبعاد ويقدم مثالا على تطبيق محتمل، Cot-1 RNA FISH للكشف عن الحمض النووي النووي الريبي الناشئ. يتكون الحمض النووي ل Cot-1 من عناصر متكررة في الجينوم. هنا، يتم تهجين مسبار الحمض النووي Cot-1 إلى intron و UTR من النصوص الوليدة، وبالتالي الكشف عن المناطق النشطة نسخيا في النواة5،6. الشرائح ثلاثية الأبعاد متعددة الاستخدامات ويمكن تطبيقها على مزيج من تقنيات immunofluorescence والحمض النووي وRNA FISH من أجل الحصول على فحص مفصل للعلاقات المكانية بين هندسة الكروماتين.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="562">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Cot-1 DNA&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">18440-016</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Kit</td>
			<td style="width:147px;">Agilent</td>
			<td align="right" style="width:119px;">
			300380
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Herring sperm DNA Solution</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td>15634-017</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol, 200 proof (absolute)</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td align="right">111000200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2889</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Formamide deionized</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00600-00500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C8532</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:147px;">Lifeblood Medical</td>
			<td style="width:119px;">77110-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp.</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D6001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A10491-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S0389</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6757</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M0250</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">76240</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">221465</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4417</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI</td>
			<td style="width:147px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H1200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ribonucleoside-vanadyl complex</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">S1402S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Illustra MicroSpin G-50 Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">27-5330-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">5424</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Forceps</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">300-050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:147px;">Bioexpress</td>
			<td style="width:119px;">C-3262-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Cytospin 3</td>
			<td style="width:147px;">Shandon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Coplin jar</td>
			<td style="width:147px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-815</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost /Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-well dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-566-301</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover glass&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-544-G</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:297px;">Air incubator</td>
			<td style="width:147px;">Revolutionary Science</td>
			<td style="width:119px;">RS-IF-203</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells

أثناء تمايز الخلايا الجرثومية الخصية ، يتغير هيكل الكروماتين النووي بشكل ديناميكي. يصف التالي طريقة مصممة للحفاظ على ترتيب الكروماتين ثلاثي الأبعاد للخلايا الجرثومية الخصية الموجودة في الفئران؛ تم وصف هذا الأسلوب كطريقة الشريحة ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد). في هذه الطريقة ، يتم التعامل مباشرة مع أنابيب الخصية مع خطوة permeabilization أن يزيل المواد السيتوبلازمية ، تليها خطوة التثبيت الذي يصلح المواد النووية. ثم يتم فصل الأنابيب، وتعليق الخلية هو cytospun، والخلايا تلتزم الشرائح. هذه الطريقة تحسن الحساسية تجاه الكشف عن الهياكل دون النووية وتنطبق على الفلورة المناعية والحمض النووي وفلور الحمض النووي الريبي في التهجين الموقعي (FISH) والجمع بين طرق الكشف هذه. كمثال على تطبيق محتمل لأسلوب الشريحة ثلاثية الأبعاد، يظهر جهاز COT-1 RNA FISH للكشف عن الحمض النووي الريبي الوليد. تسهل طريقة الشريحة ثلاثية الأبعاد الفحص التفصيلي للعلاقات المكانية بين بنية الكروماتين والحمض النووي والحمض النووي الريبي أثناء تمايز الخلايا الجرثومية الخصية.

تظهر نتيجة تمثيلية لشريحة ثلاثية الأبعاد في الشكل 2. في هذه التجربة، تم إجراء Cot-1 RNA FISH للكشف عن النسخ الوليد جنبا إلى جنب مع التلطخ المناعي باستخدام الأجسام المضادة CBX1 و γH2AX. للجمع بين RNA FISH و المناعة ، تم إجراء التلطخ المناعي أولا ، يليه RNA FISH كما هو موضح في3. CBX1 هو بروتين هيتير?...

Watch this Scientific Journal Video about Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells at JoVE.com

Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells

طريقة إعداد الشرائح للحفاظ على هندسة الكروماتين ثلاثية الأبعاد للخلايا الجرثومية الخصية

تصف المادة هنا طريقة تم تطويرها للحفاظ على بنية الكروماتين ثلاثية الأبعاد للخلايا الجرثومية الخصية. وقد أطلق على هذا الأسلوب الشريحة ثلاثية الأبعاد (3D). هذه الطريقة تحسن الحساسية للكشف عن الهياكل شبه النووية وتنطبق على الفلورة المناعية والحمض النووي وفلور الحمض النووي الريبي في التهجين الموقعي (FISH).

During testicular germ cell differentiation, the structure of nuclear chromatin dynamically changes. The following describes a method designed to preserve ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

التصنيع الدقيق للرقاقة الحجم السقالات لزراعة الخلايا ثلاثي الأبعاد

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

مرحبا - C : طريقة لدراسة الهندسة المعمارية ثلاثي الأبعاد للخريطة جينوم.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

عزل الخلايا الظهارية الثديية من ثلاثي الأبعاد الخلايا المختلطة الجسم الشبه الكروي ثقافة المشارك

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

تقنيات بسيطة وفعالة لإعداد تعليق خلية الخصية

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

التفريق بين الأطفال حديثي الولادة ماوس خلايا الجلد الجذعية المشتقة في مثل جرثومة خلايا<em&gt; في المختبر</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

وسيلة فعالة للالكمي، التحليل خلية واحدة من لونين تعديل والعمارة النووية في جبل لالجامع بويضات في<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

الحنق التصوير في الهلاميات المائية ثلاثية الأبعاد

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

إعادة البناء ثلاثي الأبعاد بنية الأوعية الدموية المبيض الماوس مسح الوضوح السلبي

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

أديبو--واضحة: منديل مسح طريقة لتصوير ثلاثي الأبعاد للأنسجة الدهنية

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

وحيد الخلية القرار التصوير ثلاثي الأبعاد من organoids سليمة

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...