Name: slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells
Uploaded: 2014-01-10T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells at JoVE.com

אני מודה לג'יני טי לי על הפיקוח על הפרויקט הזה כשהייתי במעבדה של לי וטיילר ברורינג על עריכת כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי פרס בזיל אוקונור סטרטר מלומד מקרן מצעדת דימס ו- NIH Grant GM098605.

1.3D הכנת שקופיות
<ol><li>הכן את ריאגנטים הבאים:<ol>
<li>מאגר CSK: 100 mM NaCl, 300 מ"מ סוכרוז, 10 mM צינורות, 3 mM MgCl2. כוונן את ה-pH ל-6.8 עם 1 M NaOH. אחסן את מאגר CSK ב- 4 °C (69 °F).</li>
		<li>מאגר CSK עם 0.5% טריטון X-100: להוסיף 200 מיקרוליטר של טריטון X-100 כדי 40 מ"ל של מאגר CSK. מערבבים את הפתרון באמצעות stirrer מגנטי עד טריטון X-100 מומס ל...

<ol>
	<li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline.">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li><li>Namekawa, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmeiotic+sex+chromatin+in+the+male+germline+of+mice.">Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice.</a> Curr Biol. 16, 660-667 (2006).</li><li>Namekawa, S. H., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+nascent+RNA,+single-copy+DNA+and+protein+localization+by+immunoFISH+in+mouse+germ+cells+and+preimplantation+embryos.">Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos.</a> Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).</li><li>Mahadevaiah, S. K., Costa, Y., Turner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+RNA+FISH+to+study+gene+expression+during+mammalian+meiosis.">Using RNA FISH to study gene expression during mammalian meiosis.</a> Methods in molecular biology. 558, 433-444 (2009).</li><li>Hall, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ectopic+human+XIST+gene+can+induce+chromosome+inactivation+in+postdifferentiation+human+HT-1080+cells.">An ectopic human XIST gene can induce chromosome inactivation in postdifferentiation human HT-1080 cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 8677-8682 (2002).</li><li>Huynh, K. D., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+a+pre-inactivated+paternal+X+chromosome+in+early+mouse+embryos.">Inheritance of a pre-inactivated paternal X chromosome in early mouse embryos.</a> Nature. 426, 857-862 (2003).</li><li>Namekawa, S. H., VandeBerg, J. L., McCarrey, J. R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+chromosome+silencing+in+the+marsupial+male+germ+line.">Sex chromosome silencing in the marsupial male germ line.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9730-9735 (2007).</li><li>Namekawa, S. H., Payer, B., Huynh, K. D., Jaenisch, R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+imprinted+X+inactivation:+repeat+versus+genic+silencing+in+the+mouse.">Two-step imprinted X inactivation: repeat versus genic silencing in the mouse.</a> Mol Cell Biol. 30, 3187-3205 (2010).</li><li>Ichijima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MDC1+directs+chromosome-wide+silencing+of+the+sex+chromosomes+in+male+germ+cells.">MDC1 directs chromosome-wide silencing of the sex chromosomes in male germ cells.</a> Genes Dev. 25, 959-971 (2011).</li><li>Sin, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF8+regulates+active+epigenetic+modifications+and+escape+gene+activation+from+inactive+sex+chromosomes+in+post-meiotic+spermatids.">RNF8 regulates active epigenetic modifications and escape gene activation from inactive sex chromosomes in post-meiotic spermatids.</a> Genes Dev. 26, 2737-2748 (2012).</li></ol>

בהכנת שקופיות תלת-ממדיות, שלב ההחלחלה מקדים את שלב הקיבעון. שלבים אלה מבוצעים ישירות על צינוריות חצי-חצי, ובכך משמרים את מבנה הכרומטין התלת מימדי. אפשרות חלופית לשימור מבנה הכרומטין עבור RNA / DNA FISH היא לבצע את שלב permeabilization ואת שלב הקיבעון בו זמנית. טכניקה חלופית זו בוצעה בתאי נבט כיס בעוברים ?...

באשכים, תאי נבט להבדיל זרע דיפלואידית דרך מיוזיס לתוך בוגר, זרע haploid. במהלך תהליך זה, מבנה הכרומטין הגרעיני של תאי נבט הוא שיפץ באופן רציף ודינמי. ממרחי פני השטח משמשים בדרך כלל לבדיקה ציטולוגית של תאי זרע בודדים. שיטה רווחת של התפשטות פני השטח מעסיקה טיפול היפוטוני שבאמצעותו תאים זרע בודדים מופצים ומשוטחים1. תנאים אלה הם אופטימליים לניתוח מפורט של כרומוזומים מיוטיים. תכונות כרומוזומליות כגון מצב סינפטי ומוקדי רקומביניזציה נצפו בקלות בשיטה זו. עם זאת, הטיפול ההיפוטוני משבש את ארכיטקטורת הכרומטין התת-גרעיני, ולכן טכניקה זו אינה מתאימה לניתוח מבני של גרעינים. כתוצאה מכך, שיטה משופרת תוכננה כדי לשמר את מבנה הכרומטין התלת מימדי של תאי נבט האשכים. שיטה זו נקראה שיטת השקופית התלת-ממדית (3D) (איור 1). שיטת שקופית 3D אפשרה זיהוי של לוקליזציה RNA המתהווה בגרעינים כי זה היה אופטימיזציה בתחילה כדי לבחון ביטוי גנים מצבי כרומטין במהלך התמיינות תא נבט האשכים על ידי פלואורסצנטיות RNA בהכלאה situ (FISH)2,3. שיטה תלת-ממדית זו חלה גם על השילוב של כשל חיסוני, דנ"א ודגי RNA. בנוסף, שיטה זו סייעה בגילוי כרומטין מין פוסט-מיוטי (PMSC), תא שקט של כרומוזומי המין שנמצאו בזרעונים פוסט-מיוטיים2.
שיטת השקופית בתלת-ממד עברה אופטימיזציה במקור באמצעות שילוב של שני שלבים חיוניים של הכנת שקופיות המשמשים בדרך כלל לכתמים גרעיניים: שלב הקיבעון שנועד לתקן חומרים גרעיניים וצעד ההחלחלה שנועד להסיר חומרים ציטופלסמיים על מנת לשפר את הנגישות של ריאגנטים מכתימים, כגון נוגדנים ובדיקות FISH. כפי שתואר קודם לכן בפרסום אחר3, נקבע כי שלב permeabilization חייב להקדים את שלב הקיבעון על מנת להשיג תוצאות אופטימליות עם רקע ציטופלסמי נמוך. בשיטת שקופית תלת-ממדית זו, שלב ההחלחלה ושלב הקיבעון הבאים מבוצעים ישירות על צינוריות חצי-שנתיות ואחריהן הניתוק המכני של תאי נבט עם מלקחיים לפני ציטוספין על שקופיות. שיטה חלופית עבור דג RNA של תאים spermatogenic פותחה במעבדה אחרת4. בשיטה זו, בהתאם לשיטת 3D, שלב permeabilization חייב להקדים את שלב הקיבעון על מנת להשיג תוצאות אופטימליות של RNA FISH.
הפרוטוקול הבא מתאר את שיטת השקופית תלת-ממדית ומספק דוגמה ליישום אפשרי, Cot-1 RNA FISH לגילוי RNAs גרעיניים. דנ"א קוט-1 מורכב מאלמנטים שחוזרים על עצמו בגנום. כאן, גשוש DNA קוט-1 הוא היברידית אינטרון ו UTR של התמלילים המתהווים, ובכך לזהות את האזורים הפעילים שעתוק בגרעין5,6. שקופיות תלת מימד הן רב-תכליתיות וניתן ליישם אותן על שילוב של טכניקות כשל חיסוני, DNA ו- RNA FISH על מנת לקבל בדיקה מפורטת של יחסים מרחביים בין ארכיטקטורת הכרומטין.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="562">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Cot-1 DNA&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">18440-016</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Kit</td>
			<td style="width:147px;">Agilent</td>
			<td align="right" style="width:119px;">
			300380
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Herring sperm DNA Solution</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td>15634-017</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol, 200 proof (absolute)</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td align="right">111000200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2889</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Formamide deionized</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00600-00500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C8532</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:147px;">Lifeblood Medical</td>
			<td style="width:119px;">77110-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp.</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D6001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A10491-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S0389</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6757</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M0250</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">76240</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">221465</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4417</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI</td>
			<td style="width:147px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H1200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ribonucleoside-vanadyl complex</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">S1402S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Illustra MicroSpin G-50 Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">27-5330-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">5424</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Forceps</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">300-050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:147px;">Bioexpress</td>
			<td style="width:119px;">C-3262-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Cytospin 3</td>
			<td style="width:147px;">Shandon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Coplin jar</td>
			<td style="width:147px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-815</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost /Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-well dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-566-301</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover glass&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-544-G</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:297px;">Air incubator</td>
			<td style="width:147px;">Revolutionary Science</td>
			<td style="width:119px;">RS-IF-203</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells

במהלך התמיינות תאי נבט האשכים, המבנה של כרומטין גרעיני משתנה באופן דינמי. להלן שיטה שנועדה לשמר את סידור הכרומטין התלת מימדי של תאי נבט האשכים המצויים בעכברים; שיטה זו נקראה שיטת השקופית התלת-ממדית (תלת-ממדית). בשיטה זו, צינוריות האשכים מטופלים ישירות עם שלב חדירה שמסיר חומר ציטופלסמי, ואחריו שלב קיבעון שמתקן חומרים גרעיניים. לאחר מכן, הצינוריות מנותקות, השעיית התא היא ציטוספון, והתאים נצמדים לשקופיות. שיטה זו משפרת את הרגישות לגילוי מבנים תת-גרעיניים והיא ישימה עבור פלואורסצנטיות חיסונית, דנ"א ו- RNA בהכלאה במקום (FISH) והשילוב של שיטות זיהוי אלה. כדוגמה ליישום אפשרי של שיטת השקופית 3D, דג RNA Cot-1 מוצג כדי לזהות RNAs המתהווה. שיטת שקופית 3D תאפשר בדיקה מפורטת של יחסים מרחביים בין מבנה כרומטין, DNA, ו RNA במהלך התמיינות תא נבט האשכים.

תוצאה מייצגת של שקופית תלת-ממדית מוצגת באיור 2. בניסוי זה, Cot-1 RNA FISH בוצע כדי לזהות שעתוק המתהווה יחד עם immunostaining באמצעות נוגדנים נגד CBX1 ו γH2AX. כדי לשלב RNA FISH ו immunostaining, immunostaining בוצע ראשון, ואחריו RNA FISH כמתואר ב3. CBX1 הוא חלבון הטרוכרומטין הממוקם בהטרוכרומטין פריקנטרומרי וכרומוזומ?...

Watch this Scientific Journal Video about Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells at JoVE.com

Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells

שיטת הכנת שקופיות לשמירה על ארכיטקטורת כרומטין תלת מימדית של תאי נבט האשכים

החומר כאן מתאר שיטה שפותחה כדי לשמר את מבנה הכרומטין התלת מימדי של תאי נבט האשכים. שיטה זו נקראה שיטת השקופית התלת-ממדית (תלת-ממדית). שיטה זו משפרת את הרגישות לגילוי מבנים תת-גרעיניים והיא ישימה עבור פלואורסצנטיות חיסונית, דנ"א ופלואורסצנטיות RNA בהכלאה במקום (FISH).

During testicular germ cell differentiation, the structure of nuclear chromatin dynamically changes. The following describes a method designed to preserve ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Microfabrication של שבב בגודל פיגומים לעיבוד תלת ממדי נייד

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

Hi-C: שיטה לחקר ארכיטקטורה תלת ממדי של הגנום.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

בידוד של תאים אפיתל החלב של תלת ממדי תאים משולבים תרבות משותפת אליפטית

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

טכניקה פשוטה ויעילה להכנת השעיות תא אשכים

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

התמיינות של תאי העור של עכבר יילוד נגזר גזע לתאים דמוי נבט<em&gt; במבחנה</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

שיטה יעילה לניתוח כמותי, תא בודד של הכרומטין שינוי ואדריכלות גרעינית בהר שלם-ביציות ב<em&gt; ארבידופסיס</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

סריג הדמיה ב הידרוג תלת ממדי

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

שחזור תלת מימדי של הארכיטקטורה כלי הדם של השחלה העכבר בהירות-והפנים פסיבי

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-ברור: רקמה ניקוי שיטה עבור הדמיה תלת-ממדית של רקמת שומן

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה חד-תאית של אורגנואידים שלמים

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...