Name: slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells
Uploaded: 2014-01-10T14:15:00
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मैं इस परियोजना के पर्यवेक्षण के लिए जैनी टी ली शुक्रिया अदा करता हूं जब मैं पांडुलिपि संपादन के लिए ली प्रयोगशाला और टायलर Broering में था । इस काम को मार्च ऑफ डाइम्स फाउंडेशन और एनआईएच ग्रांट GM098605 से तुलसी ओ कॉनर स्टार्टर स्कॉलर अवार्ड द्वारा समर्थित किया गया था।

1.3D स्लाइड तैयारी
<ol><li>निम्नलिखित अभिकर् ता तैयार करें:<ol>
<li>सीएसके बफर: 100 एमएम एनएसीएल, 300 एमएम सुक्रोज, 10 एमएम पाइप, 3 एमएम एमजीसीएल2। पीएच को 1 एम नाओएच के साथ 6.8 पर समायोजित करें। सीएसके बफर को 4 डिग्री सेल्...

<ol>
	<li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline.">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li><li>Namekawa, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmeiotic+sex+chromatin+in+the+male+germline+of+mice.">Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice.</a> Curr Biol. 16, 660-667 (2006).</li><li>Namekawa, S. H., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+nascent+RNA,+single-copy+DNA+and+protein+localization+by+immunoFISH+in+mouse+germ+cells+and+preimplantation+embryos.">Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos.</a> Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).</li><li>Mahadevaiah, S. K., Costa, Y., Turner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+RNA+FISH+to+study+gene+expression+during+mammalian+meiosis.">Using RNA FISH to study gene expression during mammalian meiosis.</a> Methods in molecular biology. 558, 433-444 (2009).</li><li>Hall, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ectopic+human+XIST+gene+can+induce+chromosome+inactivation+in+postdifferentiation+human+HT-1080+cells.">An ectopic human XIST gene can induce chromosome inactivation in postdifferentiation human HT-1080 cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 8677-8682 (2002).</li><li>Huynh, K. D., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+a+pre-inactivated+paternal+X+chromosome+in+early+mouse+embryos.">Inheritance of a pre-inactivated paternal X chromosome in early mouse embryos.</a> Nature. 426, 857-862 (2003).</li><li>Namekawa, S. H., VandeBerg, J. L., McCarrey, J. R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+chromosome+silencing+in+the+marsupial+male+germ+line.">Sex chromosome silencing in the marsupial male germ line.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9730-9735 (2007).</li><li>Namekawa, S. H., Payer, B., Huynh, K. D., Jaenisch, R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+imprinted+X+inactivation:+repeat+versus+genic+silencing+in+the+mouse.">Two-step imprinted X inactivation: repeat versus genic silencing in the mouse.</a> Mol Cell Biol. 30, 3187-3205 (2010).</li><li>Ichijima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MDC1+directs+chromosome-wide+silencing+of+the+sex+chromosomes+in+male+germ+cells.">MDC1 directs chromosome-wide silencing of the sex chromosomes in male germ cells.</a> Genes Dev. 25, 959-971 (2011).</li><li>Sin, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF8+regulates+active+epigenetic+modifications+and+escape+gene+activation+from+inactive+sex+chromosomes+in+post-meiotic+spermatids.">RNF8 regulates active epigenetic modifications and escape gene activation from inactive sex chromosomes in post-meiotic spermatids.</a> Genes Dev. 26, 2737-2748 (2012).</li></ol>

3डी स्लाइड तैयारी में, पारमेबिलाइजेशन चरण निर्धारण चरण से पहले है। ये कदम सीधे अर्धनिफेरस ट्यूबलों पर किए जाते हैं, जिससे त्रि-आयामी क्रोमेटिन संरचना का संरक्षण होता है। आरएनए/डीएनए फिश के लिए क्रोमेट...

टेस्ट में, रोगाणु कोशिकाएं मेयोसिस के माध्यम से डिप्लॉयड शुक्राणुओं से परिपक्व, हैप्लॉयड शुक्राणुटोजोआ में अंतर करती हैं। इस प्रक्रिया के दौरान, रोगाणु कोशिकाओं की परमाणु क्रोमेटिन संरचना लगातार और गतिशील रूप से फिर से तैयार की जाती है। सतह फैलता आमतौर पर व्यक्तिगत शुक्राणुओं की कोशिकाओं की साइटोलॉजिकल परीक्षा के लिए उपयोग किया जाता है। सतह के प्रसार की एक प्रचलित विधि हाइपोटोनिक उपचार को नियोजित करती है जिसके द्वारा अलग - अलग शुक्राणुओं की कोशिकाएं फैलती हैं और 1 को समतल कियाजाताहै । ये स्थितियां मेयोटिक गुणसूत्रों के विस्तृत विश्लेषण के लिए इष्टतम हैं। इस विधि का उपयोग करके सिनैप्टिक स्थिति और पुनर्संयोजन फोसी जैसी गुणसूत्र विशेषताएं आसानी से देखी जाती हैं। हालांकि, हाइपोटोनिक उपचार उपन्यूक्लियर क्रोमेटिन वास्तुकला को बाधित करता है, इस प्रकार यह तकनीक नाभिक के संरचनात्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं है। नतीजतन, वृषण रोगाणु कोशिकाओं की त्रि-आयामी क्रोमेटिन संरचना को संरक्षित करने के लिए एक बेहतर विधि तैयार की गई है। इस विधि को त्रि-आयामी (3डी) स्लाइड विधि(चित्रा 1)कहा गया है। 3डी स्लाइड विधि ने नाभिक में नवजात आरएनए स्थानीयकरण का पता लगाने में सक्षम बनाया है क्योंकि इसे शुरू में सीटू संकरण (मछली)2,3में आरएनए फ्लोरेसेंस द्वारा वृषण रोगाणु कोशिका भेदभाव के दौरान जीन अभिव्यक्ति और क्रोमेटिन राज्यों की जांच करने के लिए अनुकूलित किया गया था। यह 3 डी विधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस, डीएनए और आरएनए फिश के संयोजन पर भी लागू होती है। इसके अतिरिक्त, इस विधि ने पोस्टमेयोटिक सेक्स क्रोमेटिन (पीएमएससी) की खोज में सहायता की है, जो पोस्टमेयोटिक शुक्राणुओं में पाए जाने वाले सेक्स गुणसूत्रों का एक मूक डिब्बाहै 2।
3 डी स्लाइड विधि मूल रूप से आमतौर पर परमाणु धुंधला के लिए इस्तेमाल स्लाइड तैयारी के दो आवश्यक चरणों के संयोजन के माध्यम से अनुकूलित किया गया था: निर्धारण के लिए परमाणु सामग्री को ठीक करने के लिए डिज़ाइन किया गया कदम और पारमेपन कदम के लिए साइटोप्लाज्मिक सामग्री को दूर करने के लिए इस तरह के एंटीबॉडी और मछली जांच के रूप में धुंधला अभिवात की पहुंच में सुधार करने के लिए । जैसा कि पहले एक अन्य प्रकाशन3में वर्णित है, यह निर्धारित किया गया है कि कम साइटोप्लाज्मिक पृष्ठभूमि के साथ इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए पारमेबिलाइजेशन चरण को निर्धारण चरण से पहले होना चाहिए। इस 3 डी स्लाइड विधि में, परमेबिलाइजेशन चरण और बाद में निर्धारण चरण सीधे अर्धनिफेरस ट्यूबल पर किया जाता है और इसके बाद स्लाइड पर साइटोस्पिनिंग से पहले संदंश के साथ रोगाणु कोशिकाओं के यांत्रिक वियोजन होते हैं। शुक्राणुओं की कोशिकाओं की आरएनए मछली के लिए एक वैकल्पिक विधिदूसरीप्रयोगशाला में विकसित की गई थी । इस विधि में, 3 डी विधि के अनुरूप, पारमेबिलाइजेशन चरण को आरएनए मछली के इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए निर्धारण चरण से पहले होना चाहिए।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल 3 डी स्लाइड विधि का वर्णन करता है और परमाणु नवजात आरएनए का पता लगाने के लिए संभावित आवेदन, खाट-1 आरएनए मछली का एक उदाहरण प्रदान करता है। खाट-1 डीएनए में जीनोम में दोहराव वाले तत्व होते हैं। यहां, एक खाट-1 डीएनए जांच नवजात प्रतिलिपियों के एक इंट्रॉन और यूटीआर के लिए संकरित है, जिससे नाभिक5,6में प्रतिलेखन रूप से सक्रिय क्षेत्रों का पता लगाया जाता है। क्रोमेटिन वास्तुकला के बीच स्थानिक संबंधों की विस्तृत जांच प्राप्त करने के लिए 3 डी स्लाइड बहुमुखी हैं और इम्यूनोफ्लोरेसेंस, डीएनए और आरएनए फिश तकनीकों के संयोजन के लिए लागू की जा सकती हैं।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="562">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Cot-1 DNA&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">18440-016</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Kit</td>
			<td style="width:147px;">Agilent</td>
			<td align="right" style="width:119px;">
			300380
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Herring sperm DNA Solution</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td>15634-017</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol, 200 proof (absolute)</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td align="right">111000200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2889</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Formamide deionized</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00600-00500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C8532</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:147px;">Lifeblood Medical</td>
			<td style="width:119px;">77110-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp.</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D6001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A10491-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S0389</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6757</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M0250</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">76240</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">221465</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4417</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI</td>
			<td style="width:147px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H1200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ribonucleoside-vanadyl complex</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">S1402S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Illustra MicroSpin G-50 Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">27-5330-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">5424</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Forceps</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">300-050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:147px;">Bioexpress</td>
			<td style="width:119px;">C-3262-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Cytospin 3</td>
			<td style="width:147px;">Shandon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Coplin jar</td>
			<td style="width:147px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-815</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost /Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-well dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-566-301</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover glass&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-544-G</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:297px;">Air incubator</td>
			<td style="width:147px;">Revolutionary Science</td>
			<td style="width:119px;">RS-IF-203</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells

वृषण रोगाणु कोशिका भेदभाव के दौरान, परमाणु क्रोमेटिन की संरचना गतिशील रूप से बदलती है। निम्नलिखित चूहों में पाए जाने वाले वृषण रोगाणु कोशिकाओं की त्रि-आयामी क्रोमेटिन व्यवस्था को संरक्षित करने के लिए डिज़ाइन की गई एक विधि का वर्णन करता है; इस विधि को त्रि-आयामी (3 डी) स्लाइड विधि कहा गया है। इस विधि में, वृषण ट्यूबलों को सीधे एक पारमेबिलाइजेशन कदम के साथ माना जाता है जो साइटोप्लाज्मिक सामग्री को हटा देता है, जिसके बाद एक निर्धारण कदम होता है जो परमाणु सामग्रियों को ठीक करता है। ट्यूबल्स को फिर अलग किया जाता है, सेल निलंबन साइटोस्पन है, और कोशिकाएं स्लाइड्स का पालन करती हैं। यह विधि उपनकीय संरचनाओं का पता लगाने के प्रति संवेदनशीलता में सुधार करती है और सिटू संकरण (मछली) में इम्यूनोफ्लोरेसेंस, डीएनए और आरएनए फ्लोरेसेंस और इन डिटेक्शन विधियों के संयोजन के लिए लागू होती है। 3 डी स्लाइड विधि के संभावित अनुप्रयोग के उदाहरण के रूप में, एक खाट-1 आरएनए मछली नवजात आरएनए का पता लगाने के लिए दिखाया गया है। 3 डी स्लाइड विधि वृषण रोगाणु कोशिका भेदभाव के दौरान क्रोमेटिन संरचना, डीएनए और आरएनए के बीच स्थानिक संबंधों की विस्तृत जांच की सुविधा प्रदान करेगी।

3डी स्लाइड का एक प्रतिनिधि परिणाम चित्र 2 में दिखाया गयाहै । इस प्रयोग में, कॉट-1 आरएनए फिश को एंटी CBX1 और γH2AX एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोस्टेपिंग के साथ नवजात प्रतिलेखन का पता लगाने के लिए किया गया...

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Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells

टेस्टिकुलर रोगाणु कोशिकाओं के त्रि-आयामी क्रोमेटिन आर्किटेक्चर को संरक्षित करने के लिए स्लाइड तैयारी विधि

यहां सामग्री वृषण रोगाणु कोशिकाओं की त्रि-आयामी क्रोमेटिन संरचना को संरक्षित करने के लिए विकसित एक विधि का वर्णन करती है। इसे थ्री-डायमेंशनल (3डी) स्लाइड मेथड करार दिया गया है। यह विधि उपनकीय संरचनाओं का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता में सुधार करती है और सीटू संकरण (मछली) में इम्यूनोफ्लोरेसेंस, डीएनए और आरएनए फ्लोरेसेंस के लिए लागू होती है।

During testicular germ cell differentiation, the structure of nuclear chromatin dynamically changes. The following describes a method designed to preserve ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

चिप आकार scaffolds के तीन आयामी सेल की खेती के लिए Microfabrication

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

हाय-C: विधि अध्ययन जीनोम के तीन आयामी वास्तुकला.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

तीन आयामी मिश्रित सेल उपगोल सह संस्कृति से स्तन उपकला कोशिकाओं का अलगाव

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

वृषण सेल निलंबन की तैयारी के लिए सरल और कारगर तकनीक

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

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रोगाणु की तरह कोशिकाओं में नवजात माउस त्वचा प्राप्त स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव<em&gt; इन विट्रो में</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

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साबुत माउंट बीजाणु में में chromatin संशोधन और परमाणु वास्तुकला के मात्रात्मक, एकल कोशिका विश्लेषण के लिए एक कारगर तरीका<em&gt; एराबिडोप्सिस</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

तीन आयामी hydrogels में इमेजिंग झल्लाहट

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

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निष्क्रिय स्पष्टता-साफ़ माउस अंडाशय के संवहनी वास्तुकला के तीन आयामी पुनर्निर्माण

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

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Adipo-स्पष्ट: वसा ऊतक के तीन आयामी इमेजिंग के लिए एक ऊतक समाशोधन विधि

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Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

बरकरार ऑर्गेनॉइड के सिंगल-सेल रिज़ॉल्यूशन थ्री-डायमेंशनल इमेजिंग

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...