Name: slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells
Uploaded: 2014-01-10T14:15:00
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Ringrazio Jeannie T. Lee per la supervisione di questo progetto quando ero nel laboratorio di Lee e Tyler Broering per aver modificato il manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dal Basil O'Connor Starter Scholar Award della March of Dimes Foundation e dal NIH Grant GM098605.

1.3D preparazione delle diapositive
<ol><li>Preparare i seguenti reagenti:<ol>
<li>Tampone CSK: NaCl da 100 mM, saccarosio da 300 mM, tubi da 10 mM, 3 mM MgCl2. Regolare il pH a 6,8 con 1 M NaOH. Conservare il buffer CSK a 4 °C.</li>
		<li>Tampone CSK con 0,5% Tritone X-100: Aggiungere 200 μl di Tritone X-100 a 40 ml di tampone CSK. Mescolare la soluzione utilizzando l'agitatore magnetico fino a quando Triton X-100 non viene completamente sciolto. Conservare il buffer CSK con 0,5% Tritone X-100 a 4 °C.</l...

<ol>
	<li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline.">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li><li>Namekawa, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmeiotic+sex+chromatin+in+the+male+germline+of+mice.">Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice.</a> Curr Biol. 16, 660-667 (2006).</li><li>Namekawa, S. H., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+nascent+RNA,+single-copy+DNA+and+protein+localization+by+immunoFISH+in+mouse+germ+cells+and+preimplantation+embryos.">Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos.</a> Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).</li><li>Mahadevaiah, S. K., Costa, Y., Turner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+RNA+FISH+to+study+gene+expression+during+mammalian+meiosis.">Using RNA FISH to study gene expression during mammalian meiosis.</a> Methods in molecular biology. 558, 433-444 (2009).</li><li>Hall, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ectopic+human+XIST+gene+can+induce+chromosome+inactivation+in+postdifferentiation+human+HT-1080+cells.">An ectopic human XIST gene can induce chromosome inactivation in postdifferentiation human HT-1080 cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 8677-8682 (2002).</li><li>Huynh, K. D., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+a+pre-inactivated+paternal+X+chromosome+in+early+mouse+embryos.">Inheritance of a pre-inactivated paternal X chromosome in early mouse embryos.</a> Nature. 426, 857-862 (2003).</li><li>Namekawa, S. H., VandeBerg, J. L., McCarrey, J. R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+chromosome+silencing+in+the+marsupial+male+germ+line.">Sex chromosome silencing in the marsupial male germ line.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9730-9735 (2007).</li><li>Namekawa, S. H., Payer, B., Huynh, K. D., Jaenisch, R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+imprinted+X+inactivation:+repeat+versus+genic+silencing+in+the+mouse.">Two-step imprinted X inactivation: repeat versus genic silencing in the mouse.</a> Mol Cell Biol. 30, 3187-3205 (2010).</li><li>Ichijima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MDC1+directs+chromosome-wide+silencing+of+the+sex+chromosomes+in+male+germ+cells.">MDC1 directs chromosome-wide silencing of the sex chromosomes in male germ cells.</a> Genes Dev. 25, 959-971 (2011).</li><li>Sin, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF8+regulates+active+epigenetic+modifications+and+escape+gene+activation+from+inactive+sex+chromosomes+in+post-meiotic+spermatids.">RNF8 regulates active epigenetic modifications and escape gene activation from inactive sex chromosomes in post-meiotic spermatids.</a> Genes Dev. 26, 2737-2748 (2012).</li></ol>

Nella preparazione della diapositiva 3D, la fase di permeabilizzazione precede la fase di fissazione. Questi passaggi vengono eseguiti direttamente su tubuli seminiferi, preservando così la struttura tridimensionale della cromatina. Un'opzione alternativa per preservare la struttura della cromatina per RNA / DNA FISH è eseguire contemporaneamente la fase di permeabilizzazione e la fase di fissazione. Questa tecnica alternativa è stata eseguita nelle cellule germinali marsupiali e negli embrioni di preimpianto del...

Nei teste, le cellule germinali si differenziano dalla spermatogonia diploide attraverso la meiosi in spermatozoi maturi e aploidi. Durante questo processo, la struttura della cromatina nucleare delle cellule germinali viene continuamente e dinamicamente rimodellata. Le crepa superficiali sono comunemente utilizzate per l'esame citologico delle singole cellule spermatogeniche. Un metodo prevalente di diffusione superficiale utilizza un trattamento ipotonico con cui le singole cellule spermatogeniche vengono diffuse e appiattite1. Queste condizioni sono ottimali per l'analisi dettagliata dei cromosomi meiotici. Le caratteristiche cromosomiche come lo stato sinaptico e i focolai di ricombinazione sono facilmente osservabili usando questo metodo. Tuttavia, il trattamento ipotonico interrompe l'architettura della cromatina subnucleare, quindi questa tecnica non è adatta per l'analisi strutturale dei nuclei. Di conseguenza, è stato progettato un metodo migliorato per preservare la struttura tridimensionale della cromatina delle cellule germinali testicolari. Questo metodo è stato definito metodo di scorrimento tridimensionale (3D) (Figura 1). Il metodo di scorrimento 3D ha permesso il rilevamento della nascente localizzazione dell'RNA nei nuclei perché inizialmente è stato ottimizzato per esaminare l'espressione genica e gli stati di cromatina durante la differenziazione delle cellule germinali testicolari mediante ibridazione della fluorescenza dell'RNA in situ (FISH)2,3. Questo metodo 3D è applicabile anche alla combinazione di immunofluorescenza, DNA e RNA FISH. Inoltre, questo metodo ha aiutato nella scoperta della cromatina sessuale postmeiotica (PMSC), un compartimento silenzioso dei cromosomi sessuali trovato negli spermatidi postmeiotici2.
Il metodo di scorrimento 3D è stato originariamente ottimizzato attraverso la combinazione di due fasi essenziali di preparazione dello scivolo comunemente utilizzate per la colorazione nucleare: la fase di fissazione progettata per fissare i materiali nucleari e la fase di permeabilizzazione destinata a rimuovere i materiali citoplasmatici al fine di migliorare l'accessibilità dei reagenti di colorazione, come anticorpi e sonde FISH. Come descritto in precedenza inun'altra pubblicazione 3, è stato determinato che la fase di permeabilizzazione deve precedere la fase di fissazione al fine di ottenere risultati ottimali con basso background citoplasmatico. In questo metodo di scorrimento 3D, la fase di permeabilizzazione e la successiva fase di fissazione vengono eseguite direttamente su tubuli seminiferi e sono seguite dalla dissociazione meccanica delle cellule germinali con forcep prima della citospinning su diapositive. Un metodo alternativo per RNA FISH di cellule spermatogeniche è stato sviluppato in un altro laboratorio4. In questo metodo, coerentemente con il metodo 3D, la fase di permeabilizzazione deve precedere la fase di fissazione per ottenere risultati ottimali di RNA FISH.
Il seguente protocollo descrive il metodo di scorrimento 3D e fornisce un esempio di una possibile applicazione, Cot-1 RNA FISH per il rilevamento di RNA nascenti nucleari. Il DNA Cot-1 è costituito da elementi ripetitivi nel genoma. Qui, una sonda del DNA Cot-1 è ibridata ad un introne e a un UTR delle trascrizioni nascenti, rilevando così le regioni trascrittili attive nel nucleo5,6. Le diapositive 3D sono versatili e possono essere applicate a una combinazione di tecniche di immunofluorescenza, DNA e RNA FISH al fine di ottenere un esame dettagliato delle relazioni spaziali tra l'architettura della cromatina.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="562">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Cot-1 DNA&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">18440-016</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Kit</td>
			<td style="width:147px;">Agilent</td>
			<td align="right" style="width:119px;">
			300380
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Herring sperm DNA Solution</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td>15634-017</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol, 200 proof (absolute)</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td align="right">111000200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2889</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Formamide deionized</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00600-00500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C8532</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:147px;">Lifeblood Medical</td>
			<td style="width:119px;">77110-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp.</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D6001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A10491-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S0389</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6757</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M0250</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">76240</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">221465</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4417</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI</td>
			<td style="width:147px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H1200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ribonucleoside-vanadyl complex</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">S1402S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Illustra MicroSpin G-50 Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">27-5330-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">5424</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Forceps</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">300-050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:147px;">Bioexpress</td>
			<td style="width:119px;">C-3262-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Cytospin 3</td>
			<td style="width:147px;">Shandon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Coplin jar</td>
			<td style="width:147px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-815</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost /Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-well dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-566-301</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover glass&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-544-G</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:297px;">Air incubator</td>
			<td style="width:147px;">Revolutionary Science</td>
			<td style="width:119px;">RS-IF-203</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells

Durante la differenziazione testicolare delle cellule germinali, la struttura della cromatina nucleare cambia dinamicamente. Di seguito viene descritto un metodo progettato per preservare la disposizione tridimensionale della cromatina delle cellule germinali testicolari presenti nei topi; questo metodo è stato definito come il metodo di scorrimento tridimensionale (3D). In questo metodo, i tubuli testicolari vengono trattati direttamente con una fase di permeabilizzazione che rimuove il materiale citoplasmatico, seguito da una fase di fissazione che fissa i materiali nucleari. I tubuli vengono quindi dissociati, la sospensione cellulare è citospun e le cellule aderiscono alle diapositive. Questo metodo migliora la sensibilità verso il rilevamento di strutture subnucleari ed è applicabile per l'immunofluorescenza, il DNA e la fluorescenza dell'RNA nell'ibridazione in situ (FISH) e la combinazione di questi metodi di rilevamento. Come esempio di una possibile applicazione del metodo di scorrimento 3D, viene mostrato un COT-1 RNA FISH per rilevare gli RNA nascenti. Il metodo di scorrimento 3D faciliterà l'esame dettagliato delle relazioni spaziali tra la struttura della cromatina, il DNA e l'RNA durante la differenziazione delle cellule germinali testicolari.

Un risultato rappresentativo di una diapositiva 3D è mostrato nella figura 2. In questo esperimento, Cot-1 RNA FISH è stato eseguito per rilevare la trascrizione nascente insieme all'immunostaining usando anticorpi anti CBX1 e γH2AX. Per combinare RNA FISH e immunostaining, l'immunostaining è stato eseguito per primo, seguito da RNA FISH come descritto in3. La CBX1 è una proteina eterocromatina che si localizza in eterocromatina pericentromerica e cromosomi sessuali silenziosi in meiosi c...

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Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells

Metodo di preparazione delle diapositive per preservare l'architettura tridimensionale della cromatina delle cellule germinali testicolari

Il materiale qui descrive un metodo sviluppato per preservare la struttura tridimensionale della cromatina delle cellule germinali testicolari. Questo è stato definito il metodo di scorrimento tridimensionale (3D). Questo metodo migliora la sensibilità per il rilevamento di strutture subnucleari ed è applicabile per l'immunofluorescenza, il DNA e la fluorescenza dell'RNA nell'ibridazione in situ (FISH).

During testicular germ cell differentiation, the structure of nuclear chromatin dynamically changes. The following describes a method designed to preserve ...

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