Name: slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells
Uploaded: 2014-01-10T14:15:00
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私がリー研究所にいたとき、このプロジェクトを監督してくれたジニー・T・リーと、原稿を編集してくれたタイラー・ブローリングに感謝します。この作品は、ダイムズ財団のマーチからバジル・オコナースタータースカラー賞とNIHグラントGM098605によって支えられました。

1.3D スライドの準備
<ol><li>以下の試薬を準備します。<ol>
<li>CSKバッファ:100 mM NaCl、300 mMスクロース、10 mMパイプ、3 mM MgCl2.1 M NaOH で pH を 6.8 に調整します。CSKバッファーは4°Cで保管してください。</li>
		<li>0.5%トリトンX-100のCSKバッファ:200 μlのトリトンX-100から40 mlのCSKバッファを加えます。トリトンX-100が完全に溶解するまで、磁気撹拌機を使用して溶液を混合します。CSKバッファー...

<ol>
	<li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline.">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li><li>Namekawa, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmeiotic+sex+chromatin+in+the+male+germline+of+mice.">Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice.</a> Curr Biol. 16, 660-667 (2006).</li><li>Namekawa, S. H., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+nascent+RNA,+single-copy+DNA+and+protein+localization+by+immunoFISH+in+mouse+germ+cells+and+preimplantation+embryos.">Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos.</a> Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).</li><li>Mahadevaiah, S. K., Costa, Y., Turner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+RNA+FISH+to+study+gene+expression+during+mammalian+meiosis.">Using RNA FISH to study gene expression during mammalian meiosis.</a> Methods in molecular biology. 558, 433-444 (2009).</li><li>Hall, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ectopic+human+XIST+gene+can+induce+chromosome+inactivation+in+postdifferentiation+human+HT-1080+cells.">An ectopic human XIST gene can induce chromosome inactivation in postdifferentiation human HT-1080 cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 8677-8682 (2002).</li><li>Huynh, K. D., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+a+pre-inactivated+paternal+X+chromosome+in+early+mouse+embryos.">Inheritance of a pre-inactivated paternal X chromosome in early mouse embryos.</a> Nature. 426, 857-862 (2003).</li><li>Namekawa, S. H., VandeBerg, J. L., McCarrey, J. R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+chromosome+silencing+in+the+marsupial+male+germ+line.">Sex chromosome silencing in the marsupial male germ line.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9730-9735 (2007).</li><li>Namekawa, S. H., Payer, B., Huynh, K. D., Jaenisch, R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+imprinted+X+inactivation:+repeat+versus+genic+silencing+in+the+mouse.">Two-step imprinted X inactivation: repeat versus genic silencing in the mouse.</a> Mol Cell Biol. 30, 3187-3205 (2010).</li><li>Ichijima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MDC1+directs+chromosome-wide+silencing+of+the+sex+chromosomes+in+male+germ+cells.">MDC1 directs chromosome-wide silencing of the sex chromosomes in male germ cells.</a> Genes Dev. 25, 959-971 (2011).</li><li>Sin, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF8+regulates+active+epigenetic+modifications+and+escape+gene+activation+from+inactive+sex+chromosomes+in+post-meiotic+spermatids.">RNF8 regulates active epigenetic modifications and escape gene activation from inactive sex chromosomes in post-meiotic spermatids.</a> Genes Dev. 26, 2737-2748 (2012).</li></ol>

3Dスライドの準備では、パーメアビライゼーションステップは固定ステップの前に行います。これらのステップは、半細管上で直接行われ、それによって、3次元クロマチン構造を維持する。RNA/DNA FISHのクロマチン構造を保存するための代替オプションは、パーメアビライゼーションステップと固定ステップを同時に行うことである。この代替技術は、有袋類生殖細胞およびマウスの着床前胚<...

精巣では、生殖細胞は、二数葉化精子腫から、成熟したハプロイド精子に対するマイオシスを介して分化する。この過程において、胚芽細胞の核クロマチン構造は、連続的かつ動的に再モデル化される。表面の広がりは、個々の精子細胞の細胞学的検査に一般的に使用される。表面広がりの一般的な方法は、個々の精子細胞が広がり、平坦化される低調薬治療を採用する1.これらの条件は、精密染色体の詳細な分析に最適です。シナプス状態や再結合病巣などの染色体特徴は、この方法を用いて容易に観察される。しかし、低張治療は亜核クロマチンアーキテクチャを破壊し、したがってこの技術は核の構造解析には適さない。その結果、精巣生殖細胞の三次元クロマチン構造を維持するように改良された方法が設計されている。この方法は、3次元(3D)スライド法と呼ばれる(図1)。3Dスライド法は、その現場でのRNA蛍光による精巣胚芽細胞分化中の遺伝子発現およびクロマチン状態を調べるために最初に最適化されたため、核内の新生RNA局在化の検出を可能にした(FISH)2,3。この3D法は、免疫蛍光、DNA、RNA FISHの組み合わせにも適用可能です。さらに、この方法は、ポストメオティック性クロマチン(PMSC)の発見に役立ち、ポストメオティック精子2に見られる性染色体の無声コンパートメントである。
3Dスライド法は、核染色に一般的に使用されるスライド調製の2つの重要なステップの組み合わせによって、もともと最適化されました:核物質を固定するために設計された固定ステップと、抗体やFISHプローブなどの染色試薬の入手可能性を向上させるために細胞質材料を除去することを意図した透過性ステップ。他の刊行3で既に説明したように、低細胞質バックグラウンドで最適な結果を得るためには、パーメアビレーションステップが固定工程の前になければならないことが決定された。この3Dスライド法では、透過化ステップとその後の固定ステップを半細管上で直接行い、続いて細胞回転前に細胞を鉗子で生殖細胞を滑らかに回転させます。精子細胞のRNA FISHの代替方法が別の実験室4で開発された。この方法では、3D法と一致し、RNA FISHの最適な結果を得るためにパーメアビライゼーションステップが固定工程の前になければなりません。
以下のプロトコルは、3Dスライド法について説明し、核新生RNAの検出に可能な応用例であるCot-1 RNA FISHを提供する。Cot-1 DNAは、ゲノム中の反復的な要素から構成されています。ここで、Cot-1 DNAプローブは、新生転写物のイントロンとUTRにハイブリダイズされ、核5,6内の転写活性領域を検出する。3Dスライドは汎用性が高く、クロマチンアーキテクチャ間の空間的関係の詳細な検査を得るために、免疫蛍光、DNAおよびRNA FISH技術の組み合わせに適用することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="562">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Cot-1 DNA&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">18440-016</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Kit</td>
			<td style="width:147px;">Agilent</td>
			<td align="right" style="width:119px;">
			300380
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Herring sperm DNA Solution</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td>15634-017</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol, 200 proof (absolute)</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td align="right">111000200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2889</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Formamide deionized</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00600-00500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C8532</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:147px;">Lifeblood Medical</td>
			<td style="width:119px;">77110-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp.</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D6001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A10491-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S0389</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6757</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M0250</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">76240</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">221465</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4417</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI</td>
			<td style="width:147px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H1200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ribonucleoside-vanadyl complex</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">S1402S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Illustra MicroSpin G-50 Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">27-5330-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">5424</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Forceps</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">300-050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:147px;">Bioexpress</td>
			<td style="width:119px;">C-3262-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Cytospin 3</td>
			<td style="width:147px;">Shandon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Coplin jar</td>
			<td style="width:147px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-815</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost /Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-well dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-566-301</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover glass&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-544-G</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:297px;">Air incubator</td>
			<td style="width:147px;">Revolutionary Science</td>
			<td style="width:119px;">RS-IF-203</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells

精巣胚芽細胞分化の間、核クロマチンの構造は動的に変化する。以下は、マウスに見られる精巣生殖細胞の三次元クロマチン配置を維持するために設計された方法を説明します;この方法は三次元(3D)スライド法と呼ばれる。この方法では、精巣細管は細胞質材料を除去する透過性のステップで直接処理され、続いて核物質を固定する固定ステップが続く。次いで、尿細管を解合し、細胞懸濁液を細胞紡ぎ、細胞はスライドに付着させる。この方法は、亜核組織の検出に対する感度を向上させ、免疫蛍光、DNA、および蛍光をその 中で の蛍光、DNA、およびRNA蛍光(FISH)およびこれらの検出方法の組み合わせに適用可能である。3Dスライド法の応用例として、Cot-1 RNA FISHが新生RNAを検出することが示されています。3Dスライド法は、精巣胚芽細胞分化中のクロマチン構造、DNA、RNA間の空間的関係の詳細な検討を容易にする。

3D スライドの代表的な結果を図 2に示します。この実験では、コト1RNA FISHを、抗CBX1およびγH2AX抗体を用いた免疫染色と共に新生転写を検出するために行った。RNA FISHと免疫染色を組み合わせるために、免疫染色を最初に行い、続いて3に記載されるRNA FISHを行った。CBX1は、XY体(または性体)と呼ばれるメイオシスにおける中心血球ヘテロクロマチンおよびサイレントセック?...

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Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells

精巣生殖細胞の三次元クロマチンアーキテクチャを保存するためのスライド調製方法

ここでの材料は精巣生殖細胞の三次元クロマチン構造を維持するために開発された方法を記述する。これは三次元(3D)スライド法と呼ばれます。この方法は、亜核組織の検出感度を向上させ、免疫蛍光、DNA、および蛍光をその 中で の蛍光(FISH)に適用可能です。

During testicular germ cell differentiation, the structure of nuclear chromatin dynamically changes. The following describes a method designed to preserve ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

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Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

ハイC：ゲノムの三次元構造を研究する方法。

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三次元混合細胞スフェロイド共培養から乳腺上皮細胞の分離

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

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Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

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Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

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