Name: slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells
Uploaded: 2014-01-10T14:15:00
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나는 리 연구소와 타일러 브루링에있을 때이 프로젝트의 감독 지니 T. 리 감사 원고를 편집. 이 작품은 Dimes 재단과 NIH 그랜트 GM098605의 3 월에서 바질 오코너 스타터 장학금 상에 의해 지원되었다.

1.3D 슬라이드 준비
<ol><li>다음 시약을 준비합니다.<ol>
<li>CSK 버퍼: 100 mM NaCl, 300 mM 자당, 10 mM 파이프, 3 mM MgCl2. pH를 1M NaOH로 6.8로 조정합니다. CSK 버퍼를 4°C에 저장합니다.</li>
		<li>0.5% 트리톤 X-100을 가진 CSK 버퍼: 트리톤 X-100 ~ 40ml의 200 μl을 CSK 버퍼를 추가합니다. 트리톤 X-100이 완전히 용해될 때까지 자기 교반기로 용액을 섞습니다. CSK 버퍼를 0.5% 트리톤 X-100을 4°C에 저장합니다.</li>
		<li>...

<ol>
	<li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline.">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li><li>Namekawa, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmeiotic+sex+chromatin+in+the+male+germline+of+mice.">Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice.</a> Curr Biol. 16, 660-667 (2006).</li><li>Namekawa, S. H., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+nascent+RNA,+single-copy+DNA+and+protein+localization+by+immunoFISH+in+mouse+germ+cells+and+preimplantation+embryos.">Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos.</a> Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).</li><li>Mahadevaiah, S. K., Costa, Y., Turner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+RNA+FISH+to+study+gene+expression+during+mammalian+meiosis.">Using RNA FISH to study gene expression during mammalian meiosis.</a> Methods in molecular biology. 558, 433-444 (2009).</li><li>Hall, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ectopic+human+XIST+gene+can+induce+chromosome+inactivation+in+postdifferentiation+human+HT-1080+cells.">An ectopic human XIST gene can induce chromosome inactivation in postdifferentiation human HT-1080 cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 8677-8682 (2002).</li><li>Huynh, K. D., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+a+pre-inactivated+paternal+X+chromosome+in+early+mouse+embryos.">Inheritance of a pre-inactivated paternal X chromosome in early mouse embryos.</a> Nature. 426, 857-862 (2003).</li><li>Namekawa, S. H., VandeBerg, J. L., McCarrey, J. R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+chromosome+silencing+in+the+marsupial+male+germ+line.">Sex chromosome silencing in the marsupial male germ line.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9730-9735 (2007).</li><li>Namekawa, S. H., Payer, B., Huynh, K. D., Jaenisch, R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+imprinted+X+inactivation:+repeat+versus+genic+silencing+in+the+mouse.">Two-step imprinted X inactivation: repeat versus genic silencing in the mouse.</a> Mol Cell Biol. 30, 3187-3205 (2010).</li><li>Ichijima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MDC1+directs+chromosome-wide+silencing+of+the+sex+chromosomes+in+male+germ+cells.">MDC1 directs chromosome-wide silencing of the sex chromosomes in male germ cells.</a> Genes Dev. 25, 959-971 (2011).</li><li>Sin, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF8+regulates+active+epigenetic+modifications+and+escape+gene+activation+from+inactive+sex+chromosomes+in+post-meiotic+spermatids.">RNF8 regulates active epigenetic modifications and escape gene activation from inactive sex chromosomes in post-meiotic spermatids.</a> Genes Dev. 26, 2737-2748 (2012).</li></ol>

3D 슬라이드 준비에서, 투과단계는 고정 단계 앞에 있다. 이러한 단계는 반열구관에서 직접 수행되어 3차원 크로마틴 구조를 보존합니다. RNA/DNA FISH에 대한 크로마틴 구조를 보존하는 대체 옵션은 투과화 단계와 고정 단계를 동시에 수행하는 것입니다. 이 대체 기술은 marsupial 세균 세포및 마우스 전 이식 배아7,8에서수행되었습니다. 그러나, 고정 단계가 투과화 단계보다 앞서는 경우, 높은 ...

고환에서, 생식 세포는 성숙으로 meiosis를 통해 diploid 정자고니아에서 분화, haploid 정자. 이 과정에서 세균 세포의 핵 크로마틴 구조는 지속적으로 동적으로 리모델링됩니다. 표면 확산은 일반적으로 개별 정자 생성 세포의 세포학적 검사에 사용됩니다. 표면 확산의 지배적인 방법은 개별 적인 정자 세포가 퍼지고 1을 평평하게 하는 저혈압 처리를채택합니다. 이 조건은 메이오성 염색체의 상세한 분석에 최적입니다. 시냅스 상태 및 재조합 포시와 같은 염색체 기능은 이 방법을 사용하여 쉽게 관찰된다. 그러나, 저혈압 처리는 핵 염색체 건축을 방해합니다, 따라서 이 기술은 핵의 구조분석에 적합하지 않습니다. 따라서, 향상된 방법은 고환 세균 세포의 3차원 크로마틴 구조를 보존하도록 설계되었습니다. 이 방법은 3차원(3D) 슬라이드방법(도 1)으로지칭되었다. 상기 3D 슬라이드 방법은 시상 혼성화(FISH)2,3에서RNA 형광에 의한 고환 세균 세포 분화 시 유전자 발현 및 크로마티닌 상태를 검사하도록 최적화되었기 때문에 핵에서 초기 RNA 국소화의 검출을 가능하게 하였다. 이 3D 방법은 면역 형광, DNA 및 RNA FISH의 조합에도 적용됩니다. 추가적으로, 이 방법은 포스트 메이오틱 성 크로마틴 (PMSC)의 발견에 도움이되었습니다, 포스트 meiotic 정자2에서발견 된 성 염색체의 조용한 구획.
3D 슬라이드 방법은 원래 핵 염색에 일반적으로 사용되는 슬라이드 제제의 두 가지 필수 단계의 조합을 통해 최적화되었다: 핵 물질을 고치기 위한 고정 단계와 세포질 물질을 제거하기 위한 투과성 단계, 항체 및 FISH 프로브와 같은 염색 시약의 접근성을 향상시키기 위한 것입니다. 앞서 다른 간행물3에설명된 바와 같이, 투과성 단계는 낮은 세포질 배경으로 최적의 결과를 얻기 위해 고정 단계에 선행되어야 한다고 판단되었다. 이 3D 슬라이드 방법에서, 투과 단계 및 후속 고정 단계는 반열관에서 직접 수행되며, 슬라이드에 사이토스피닝하기 전에 포셉을 가진 세균 세포의 기계적 해리에 선행된다. 정자 세포의 RNA FISH에 대한 대체 방법은 다른 실험실4에서개발되었다. 이 방법에서, 3D 방법과 일치, 침투 단계는 RNA FISH의 최적의 결과를 얻기 위해 고정 단계 앞에 있어야합니다.
다음 프로토콜은 3D 슬라이드 방법을 설명하고 핵 초기 RNA의 검출을 위한 가능한 응용 프로그램인 Cot-1 RNA FISH의 예를 제공한다. Cot-1 DNA는 게놈에 있는 반복적인 요소로 이루어져 있습니다. 여기서, Cot-1 DNA 프로브는 초기 성적증명서의 인트론 및 UTR에 혼성화되어 핵5,6에서전사 활성 영역을 검출한다. 3D 슬라이드는 다재다능하며 크로마틴 아키텍처 간의 공간 적 관계에 대한 상세한 검사를 얻기 위해 면역 형광, DNA 및 RNA FISH 기술의 조합에 적용 될 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="562">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Cot-1 DNA&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">18440-016</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Kit</td>
			<td style="width:147px;">Agilent</td>
			<td align="right" style="width:119px;">
			300380
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Herring sperm DNA Solution</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td>15634-017</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol, 200 proof (absolute)</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td align="right">111000200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2889</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Formamide deionized</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00600-00500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C8532</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:147px;">Lifeblood Medical</td>
			<td style="width:119px;">77110-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp.</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D6001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A10491-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S0389</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6757</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M0250</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">76240</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">221465</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4417</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI</td>
			<td style="width:147px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H1200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ribonucleoside-vanadyl complex</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">S1402S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Illustra MicroSpin G-50 Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">27-5330-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">5424</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Forceps</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">300-050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:147px;">Bioexpress</td>
			<td style="width:119px;">C-3262-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Cytospin 3</td>
			<td style="width:147px;">Shandon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Coplin jar</td>
			<td style="width:147px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-815</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost /Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-well dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-566-301</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover glass&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-544-G</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:297px;">Air incubator</td>
			<td style="width:147px;">Revolutionary Science</td>
			<td style="width:119px;">RS-IF-203</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells

고환 세균 세포 분화 하는 동안, 핵 크로마틴의 구조는 동적으로 변경. 다음은 마우스에서 발견되는 고환 세균 세포의 3차원 크로마틴 배열을 보존하도록 설계된 방법을 설명합니다. 이 방법은 3차원(3D) 슬라이드 방법으로 불려졌다. 이 방법에서 고환 튜블러는 세포질 물질을 제거하는 투과화 단계로 직접 처리되고 핵 물질을 고치는 고정 단계가 뒤따릅니다. 튜블러는 그 때 해리되고, 세포 현탁액은 시토스펀이고, 세포는 슬라이드에 부착됩니다. 이 방법은 비핵화 구조의 검출에 대한 민감도를 향상시키고, 시상 혼성화(FISH)와 이러한 검출 방법의 조합에서 면역형광, DNA 및 RNA 형광에 적용가능하다. 3D 슬라이드 방법의 가능한 적용의 예로, Cot-1 RNA FISH는 초기 RNA를 검출하는 것으로 나타났다. 3D 슬라이드 방법은 고환 세균 세포 분화 중에 크로마틴 구조, DNA 및 RNA 사이의 공간 적 관계의 상세한 검사를 용이하게 할 것이다.

3D 슬라이드의 대표적인 결과는 도 2에표시됩니다. 본 실험에서, Cot-1 RNA FISH는 항 CBX1 및 γH2AX 항체를 사용하여 면역 염색과 함께 초기 전사를 검출하기 위해 수행되었다. RNA FISH와 면역염색을 결합하기 위하여는, 면역염색은3에서기술된 바와 같이 RNA FISH에 선행된 1차 행하되었습니다. CBX1은 XY 바디 (또는 성몸)에게 불린 메이오시스에 있는 pericentromeric 이종및 침묵하는 성 염색?...

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Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells

고환 세균 세포의 3차원 크로마틴 아키텍처를 보존하는 슬라이드 준비 방법

여기서 물질은 고환 세균 세포의 3차원 크로마틴 구조를 보존하기 위해 개발된 방법을 설명한다. 이를 3차원(3D) 슬라이드 방법이라고 합니다. 이 방법은 비핵화 구조의 검출을 위한 감도를 향상시키고, 시상 혼성화(FISH)에서 면역형광, DNA 및 RNA 형광에 적용가능하다.

During testicular germ cell differentiation, the structure of nuclear chromatin dynamically changes. The following describes a method designed to preserve ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

입체 세포 배양을위한 칩 크기의 공사장 공중 발판의 Microfabrication

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

연구

생물학

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

안녕하세요 - C : Genomes의 3 차원 구조를 공부하는 방법.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

세 가지 차원 혼합 셀 회전 타원체 공동 문화에서 Mammary 상피 세포의 분리

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

고환 세포 현탁액의 준비를 위해 간단하고 효율적인 기술

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

세균과 같은 세포로 신생아 마우스 피부 유래 줄기 세포의 분화<em&gt; 체외</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

전체 마운트 난자에있는 염색질 수정 및 핵 구조의 정량, 단일 세포 분석을위한 효율적인 방법<em&gt; 애기 장대</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

3 차원 히드로 겔의 이미지를 FRET

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

수동 선명도 삭제 마우스 난소의 혈관 구조의 3 차원 재구성

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-지우기: 조직 지방 조직의 3 차원 이미징 방법 삭제

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

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Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...