Name: slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells
Uploaded: 2014-01-10T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells at JoVE.com

Jeg takker Jeannie T. Lee for tilsyn med dette prosjektet da jeg var i Lee-laboratoriet og Tyler Broering for redigering av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av Basil O'Connor Starter Scholar Award fra March of Dimes Foundation og NIH Grant GM098605.

1.3D Klargjøring av lysbilde
<ol><li>Forbered følgende reagenser:<ol>
<li>CSK buffer: 100 mM NaCl, 300 mM sukrose, 10 mM PIPES, 3 mM MgCl2. Juster pH til 6,8 med 1 M NaOH. Oppbevar CSK-bufferen ved 4 °C.</li>
		<li>CSK-buffer med 0,5 % Triton X-100: Tilsett 200 μl Triton X-100 til 40 ml CSK-buffer. Bland oppløsningen ved hjelp av magnetisk omrører til Triton X-100 er helt oppløst. Oppbevar CSK-bufferen med 0,5 % Triton X-100 ved 4 °C.</li>
		<li>4% Paraformaldehyd (PFA)–PBS, pH 7,4: Løs opp 4 g PF...

<ol>
	<li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline.">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li><li>Namekawa, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmeiotic+sex+chromatin+in+the+male+germline+of+mice.">Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice.</a> Curr Biol. 16, 660-667 (2006).</li><li>Namekawa, S. H., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+nascent+RNA,+single-copy+DNA+and+protein+localization+by+immunoFISH+in+mouse+germ+cells+and+preimplantation+embryos.">Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos.</a> Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).</li><li>Mahadevaiah, S. K., Costa, Y., Turner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+RNA+FISH+to+study+gene+expression+during+mammalian+meiosis.">Using RNA FISH to study gene expression during mammalian meiosis.</a> Methods in molecular biology. 558, 433-444 (2009).</li><li>Hall, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ectopic+human+XIST+gene+can+induce+chromosome+inactivation+in+postdifferentiation+human+HT-1080+cells.">An ectopic human XIST gene can induce chromosome inactivation in postdifferentiation human HT-1080 cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 8677-8682 (2002).</li><li>Huynh, K. D., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+a+pre-inactivated+paternal+X+chromosome+in+early+mouse+embryos.">Inheritance of a pre-inactivated paternal X chromosome in early mouse embryos.</a> Nature. 426, 857-862 (2003).</li><li>Namekawa, S. H., VandeBerg, J. L., McCarrey, J. R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+chromosome+silencing+in+the+marsupial+male+germ+line.">Sex chromosome silencing in the marsupial male germ line.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9730-9735 (2007).</li><li>Namekawa, S. H., Payer, B., Huynh, K. D., Jaenisch, R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+imprinted+X+inactivation:+repeat+versus+genic+silencing+in+the+mouse.">Two-step imprinted X inactivation: repeat versus genic silencing in the mouse.</a> Mol Cell Biol. 30, 3187-3205 (2010).</li><li>Ichijima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MDC1+directs+chromosome-wide+silencing+of+the+sex+chromosomes+in+male+germ+cells.">MDC1 directs chromosome-wide silencing of the sex chromosomes in male germ cells.</a> Genes Dev. 25, 959-971 (2011).</li><li>Sin, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF8+regulates+active+epigenetic+modifications+and+escape+gene+activation+from+inactive+sex+chromosomes+in+post-meiotic+spermatids.">RNF8 regulates active epigenetic modifications and escape gene activation from inactive sex chromosomes in post-meiotic spermatids.</a> Genes Dev. 26, 2737-2748 (2012).</li></ol>

I 3D-lysbildeforberedelse går permeabiliseringstrinnet foran fikseringstrinnet. Disse trinnene utføres direkte på seminiferøse tubuli, og bevarer dermed den tredimensjonale kromatinstrukturen. Et alternativt alternativ til å bevare kromatinstruktur for RNA/DNA FISH er å utføre permeabiliseringstrinnet og fikseringstrinnet samtidig. Denne alternative teknikken har blitt utført i buktige bakterieceller og i musepreimplantasjonsembryoer7,8. Men hvis fikseringstrinnet går foran permeabiliseringstrinnet, k...

I testikler skiller bakterieceller seg fra diploid spermatogonia gjennom meiosis til moden, haploid spermatozoa. Under denne prosessen blir den kjernefysiske kromatinstrukturen til bakterieceller kontinuerlig og dynamisk ombygd. Overflatespredninger brukes ofte til cytologisk undersøkelse av individuelle spermatogene celler. En rådende metode for overflatespredninger bruker hypotonisk behandling der individuelle spermatogene celler spres og flates1. Disse forholdene er optimale for detaljert analyse av meiotiske kromosomer. Kromosomale egenskaper som synaptisk status og rekombinasjonsfokus observeres lett ved hjelp av denne metoden. Den hypotoniske behandlingen forstyrrer imidlertid subnukleær kromatinarkitektur, og denne teknikken er derfor ikke egnet for strukturell analyse av kjerner. Følgelig er en forbedret metode designet for å bevare den tredimensjonale kromatinstrukturen til testikulære bakterieceller. Denne metoden kalles den tredimensjonale (3D) lysbildemetoden (Figur 1). 3D-lysbildemetoden har gjort det mulig å oppdage nascent RNA-lokalisering i kjerner fordi den i utgangspunktet var optimalisert for å undersøke genuttrykk og kromatintilstander under testikkel bakteriecelledifferensiering av RNA fluorescens in situ hybridisering (FISH)2,3. Denne 3D-metoden gjelder også for kombinasjonen av immunfluorescens, DNA og RNA FISH. I tillegg har denne metoden hjulpet til med oppdagelsen av postmetiotisk kjønnskromatin (PMSC), et stille rom i kjønnskromosomene som finnes i postmetiotiske spermatider2.
3D-glidemetoden ble opprinnelig optimalisert gjennom kombinasjonen av to viktige trinn i lysbildeforberedelse som vanligvis brukes til kjernefysisk farging: fikseringstrinnet designet for å fikse kjernefysiske materialer og permeabiliseringstrinnet som er ment å fjerne cytoplasmatiske materialer for å forbedre tilgjengeligheten av fargingsreagenser, for eksempel antistoffer og FISH-sonder. Som tidligere beskrevet i en annen publikasjon3, har det blitt fastslått at permeabiliseringstrinnet må komme før fikseringstrinnet for å oppnå optimale resultater med lav cytoplasmisk bakgrunn. I denne 3D-lysbildemetoden utføres permeabiliseringstrinnet og det påfølgende fikseringstrinnet direkte på seminiferøse tubuli og etterfølges av mekanisk dissosiasjon av bakterieceller med tang før cytospinning på lysbilder. En alternativ metode for RNA FISH av spermatogene celler ble utviklet i et annet laboratorium4. I denne metoden, i samsvar med 3D-metoden, må permeabiliseringstrinnet gå foran fikseringstrinnet for å oppnå optimale resultater av RNA FISH.
Følgende protokoll beskriver 3D-glidemetoden og gir et eksempel på et mulig program, Cot-1 RNA FISH for påvisning av kjernefysiske nascent RNAer. Cot-1 DNA består av repeterende elementer i genomet. Her er en Cot-1 DNA-sonde hybridisert til en intron og UTR av de ekkel transkripsjonene, og oppdager dermed de transkripsjonsaktive områdene i kjernen5,6. 3D-lysbilder er allsidige og kan brukes på en kombinasjon av immunfluorescens, DNA- og RNA FISH-teknikker for å oppnå detaljert undersøkelse av romlige sammenhenger mellom kromatinarkitektur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="562">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Cot-1 DNA&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">18440-016</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Kit</td>
			<td style="width:147px;">Agilent</td>
			<td align="right" style="width:119px;">
			300380
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Herring sperm DNA Solution</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td>15634-017</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol, 200 proof (absolute)</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td align="right">111000200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2889</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Formamide deionized</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00600-00500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C8532</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:147px;">Lifeblood Medical</td>
			<td style="width:119px;">77110-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp.</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D6001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A10491-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S0389</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6757</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M0250</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">76240</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">221465</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4417</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI</td>
			<td style="width:147px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H1200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ribonucleoside-vanadyl complex</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">S1402S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Illustra MicroSpin G-50 Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">27-5330-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">5424</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Forceps</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">300-050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:147px;">Bioexpress</td>
			<td style="width:119px;">C-3262-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Cytospin 3</td>
			<td style="width:147px;">Shandon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Coplin jar</td>
			<td style="width:147px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-815</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost /Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-well dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-566-301</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover glass&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-544-G</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:297px;">Air incubator</td>
			<td style="width:147px;">Revolutionary Science</td>
			<td style="width:119px;">RS-IF-203</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells

Under testikkel bakteriecelledifferensiering endres strukturen av kjernefysisk kromatin dynamisk. Følgende beskriver en metode designet for å bevare det tredimensjonale kromatinarrangementet av testikkel bakterieceller som finnes hos mus; Denne metoden kalles den tredimensjonale (3D) lysbildemetoden. I denne metoden behandles testikulære tubuli direkte med et permeabiliseringstrinn som fjerner cytoplasmisk materiale, etterfulgt av et fikseringstrinn som løser kjernefysiske materialer. Tubules blir deretter dissosiert, cellefjæringen er cytospun, og cellene holder seg til lysbilder. Denne metoden forbedrer følsomheten mot deteksjon av subnukleære strukturer og gjelder for immunfluorescens, DNA og RNA fluorescens in situ hybridisering (FISH) og kombinasjonen av disse deteksjonsmetodene. Som et eksempel på en mulig anvendelse av 3D-lysbildemetoden, vises en Cot-1 RNA FISH for å oppdage nascent RNAer. 3D-glidemetoden vil lette den detaljerte undersøkelsen av romlige sammenhenger mellom kromatinstruktur, DNA og RNA under testikkel bakteriecelledifferensiering.

Et representativt resultat av et 3D-lysbilde vises i figur 2. I dette eksperimentet ble Cot-1 RNA FISH utført for å oppdage nascent transkripsjon sammen med immunostaining ved hjelp av anti CBX1 og γH2AX antistoffer. For å kombinere RNA FISH og immunstaining ble immunstaining utført først, etterfulgt av RNA FISH som beskrevet i3. CBX1 er et heterokromatinprotein som lokaliserer til pericentromerisk heterokromatin og stille kjønnskromosomer i meiosis kalt en XY-kropp (eller sexkropp). γ...

Watch this Scientific Journal Video about Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells at JoVE.com

Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells

Skyv forberedelsesmetode for å bevare tredimensjonal kromatinarkitektur av testikkel bakterieceller

Materialet her beskriver en metode utviklet for å bevare den tredimensjonale kromatinstrukturen til testikulære bakterieceller. Dette kalles den tredimensjonale (3D) lysbildemetoden. Denne metoden forbedrer følsomheten for påvisning av subnukleære strukturer og gjelder for immunfluorescens, DNA og RNA fluorescens in situ hybridisering (FISH).

During testicular germ cell differentiation, the structure of nuclear chromatin dynamically changes. The following describes a method designed to preserve ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

Isolering av brystkjertelen Epitelceller fra Tredimensjonal Mikset celle Spheroid Co, kultur

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Enkel og effektiv teknikk for utarbeidelse av testikkel cellesuspensjoner

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differensiering av nyfødte mus Skin Avledet stamceller inn Germ-lignende celler<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

En effektiv metode for kvantitativ, Single-celle Analyse av Kromatin Modifikasjon og Nuclear Arkitektur i hel-mount ovules i<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

FRET Imaging i Tredimensjonal Hydrogeler

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

3-dimensjonal modell av vaskulær arkitekturen av passiv KLARHET klarert musen eggstokkene

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-Clear: En vev fjerne metoden for tredimensjonale Imaging av fettvev

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Encellede oppløsning tredimensjonal avbildning av intakte organoider

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...