Name: slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells
Uploaded: 2014-01-10T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells at JoVE.com

Jeannie T. Lee'ye lee laboratuvarındayken bu projenin denetimi için teşekkür ederim ve Tyler Broering de taslağı düzenlediği için. Bu çalışma, Dimes Vakfı'nın Yürüyüşü'nden Basil O'Connor Starter Scholar Ödülü ve NIH Grant GM098605 tarafından desteklendi.

1.3D Slayt Hazırlama
<ol><li>Aşağıdaki reaktifleri hazırlayın:<ol>
<li>CSK tamponu: 100 mM NaCl, 300 mM sakkaroz, 10 mM PIPES, 3 mM MgCl2. 1 M NaOH ile pH'ı 6,8'e ayarlayın. CSK tamponu 4 °C'de saklayın.</li>
		<li>%0,5 Triton X-100 ile CSK tamponu: 200 μl Triton X-100 ila 40 ml CSK tampon ekleyin. Triton X-100 tamamen çözünene kadar çözeltiyi manyetik karıştırıcı kullanarak karıştırın. CSK tamponu %0,5 Triton X-100 ile 4 °C'de saklayın.</li>
		<li>%4 Paraformaldehit (PFA)–PBS, p...

<ol>
	<li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline.">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li><li>Namekawa, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmeiotic+sex+chromatin+in+the+male+germline+of+mice.">Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice.</a> Curr Biol. 16, 660-667 (2006).</li><li>Namekawa, S. H., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+nascent+RNA,+single-copy+DNA+and+protein+localization+by+immunoFISH+in+mouse+germ+cells+and+preimplantation+embryos.">Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos.</a> Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).</li><li>Mahadevaiah, S. K., Costa, Y., Turner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+RNA+FISH+to+study+gene+expression+during+mammalian+meiosis.">Using RNA FISH to study gene expression during mammalian meiosis.</a> Methods in molecular biology. 558, 433-444 (2009).</li><li>Hall, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ectopic+human+XIST+gene+can+induce+chromosome+inactivation+in+postdifferentiation+human+HT-1080+cells.">An ectopic human XIST gene can induce chromosome inactivation in postdifferentiation human HT-1080 cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 8677-8682 (2002).</li><li>Huynh, K. D., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+a+pre-inactivated+paternal+X+chromosome+in+early+mouse+embryos.">Inheritance of a pre-inactivated paternal X chromosome in early mouse embryos.</a> Nature. 426, 857-862 (2003).</li><li>Namekawa, S. H., VandeBerg, J. L., McCarrey, J. R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+chromosome+silencing+in+the+marsupial+male+germ+line.">Sex chromosome silencing in the marsupial male germ line.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9730-9735 (2007).</li><li>Namekawa, S. H., Payer, B., Huynh, K. D., Jaenisch, R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+imprinted+X+inactivation:+repeat+versus+genic+silencing+in+the+mouse.">Two-step imprinted X inactivation: repeat versus genic silencing in the mouse.</a> Mol Cell Biol. 30, 3187-3205 (2010).</li><li>Ichijima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MDC1+directs+chromosome-wide+silencing+of+the+sex+chromosomes+in+male+germ+cells.">MDC1 directs chromosome-wide silencing of the sex chromosomes in male germ cells.</a> Genes Dev. 25, 959-971 (2011).</li><li>Sin, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF8+regulates+active+epigenetic+modifications+and+escape+gene+activation+from+inactive+sex+chromosomes+in+post-meiotic+spermatids.">RNF8 regulates active epigenetic modifications and escape gene activation from inactive sex chromosomes in post-meiotic spermatids.</a> Genes Dev. 26, 2737-2748 (2012).</li></ol>

3D slayt hazırlamada, permeabilizasyon adımı sabitleme adımından önce gelir. Bu adımlar doğrudan seminifer tübüller üzerinde gerçekleştirilir, böylece üç boyutlu kromatin yapısı korunur. RNA/DNA FISH için kromatin yapısını korumak için alternatif bir seçenek, permeabilizasyon adımını ve fiksasyon adımını aynı anda gerçekleştirmektir. Bu alternatif teknik keseli mikrop hücrelerinde ve fare preimplantasyon embriyolarında7,8. Ancak, sabitleme adımı permeabilizasyon adımından...

Testislerde, mikrop hücreleri diploid spermatogonia'dan meiosis yoluyla olgun, haploid spermatozoaya farklılaşır. Bu işlem sırasında mikrop hücrelerinin nükleer kromatin yapısı sürekli ve dinamik olarak yeniden şekillendirilir. Yüzey yayılımları genellikle bireysel spermatojenik hücrelerin sitolojik incelemesi için kullanılır. Yaygın bir yüzey yayılım yöntemi, bireysel spermatojenik hücrelerin yayıldığı ve düzleştirildiği hipotonik tedaviyi kullanmaktadır1. Bu koşullar meiotik kromozomların ayrıntılı analizi için en uygun olanıdır. Sinaptik durum ve rekombinasyon odakları gibi kromozomal özellikler bu yöntem kullanılarak kolayca gözlenir. Bununla birlikte, hipotonik tedavi subnükleer kromatin mimarisini bozar, bu nedenle bu teknik çekirdeklerin yapısal analizi için uygun değildir. Sonuç olarak, testis germ hücrelerinin üç boyutlu kromatin yapısını korumak için geliştirilmiş bir yöntem tasarlanmıştır. Bu yöntem üç boyutlu (3D) slayt yöntemi olarak adlanmıştır (Şekil 1). 3D slayt yöntemi, başlangıçta RNA floresan in situ hibridizasyonu (FISH)2,3ile testis germ hücre farklılaşması sırasında gen ekspresyasyonu ve kromatin durumlarını incelemek için optimize edildiği için çekirdeklerde nascent RNA lokalizasyonunun tespit edilmesini sağlamıştır. Bu 3D yöntem immünofluoresans, DNA ve RNA FISH kombinasyonu için de geçerlidir. Ek olarak, bu yöntem postmeiotik spermatidlerde bulunan cinsiyet kromozomlarının sessiz bir bölmesi olan postmeiotik cinsiyet kromatinin (PMSC) keşfine yardımcı olmuştur2.
3D slayt yöntemi başlangıçta nükleer boyama için yaygın olarak kullanılan iki temel slayt hazırlama adımının kombinasyonu ile optimize edilmiştir: nükleer malzemeleri düzeltmek için tasarlanmış sabitleme adımı ve antikorlar ve FISH probları gibi boyama reaktiflerinin erişilebilirliğini artırmak için sitoplazmik malzemelerin çıkarılması amaçlanan permeabilizasyon adımı. Daha önce başka bir yayında açıklandığı gibi3, düşük sitoplazmik arka plan ile en uygun sonuçları elde etmek için permeabilizasyon adımının sabitleme adımından önce gelmesi gerektiği belirlenmiştir. Bu 3D slayt yönteminde, permeabilizasyon adımı ve sonraki sabitleme adımı doğrudan seminifer tübüller üzerinde gerçekleştirilir ve slaytlara sitospinningden önce mikrop hücrelerinin tokalarla mekanik ayrışması ile takip edilir. Spermatojenik hücrelerin RNA BALIK için alternatif bir yöntem başka bir laboratuvarda geliştirilmiştir4. Bu yöntemde, 3D yöntemiyle tutarlı olarak, RNA FISH'in en iyi sonuçlarını elde etmek için permeabilizasyon adımının sabitleme adımından önce gelmesi gerekir.
Aşağıdaki protokol 3D slayt yöntemini açıklar ve nükleer nascent RNA'ların tespiti için olası bir uygulama olan Cot-1 RNA FISH'e bir örnek sağlar. Karyola-1 DNA'sı genomdaki tekrarlayan elementlerden oluşur. Burada, bir Cot-1 DNA probu, nascent transkriptlerinin bir intron ve UTR'sine melezlenmiştir, böylece çekirdek5,6'dakitranskripsiyonal olarak aktif bölgeleri tespit eder. Kromatin mimarisi arasındaki mekansal ilişkilerin detaylı incelenmesini sağlamak için 3D slaytlar çok yönlüdür ve immünofluoresans, DNA ve RNA FISH tekniklerinin bir kombinasyonuna uygulanabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="562">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Cot-1 DNA&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">18440-016</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Kit</td>
			<td style="width:147px;">Agilent</td>
			<td align="right" style="width:119px;">
			300380
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Herring sperm DNA Solution</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td>15634-017</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol, 200 proof (absolute)</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td align="right">111000200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2889</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Formamide deionized</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00600-00500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C8532</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:147px;">Lifeblood Medical</td>
			<td style="width:119px;">77110-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp.</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D6001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A10491-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S0389</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6757</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M0250</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">76240</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">221465</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4417</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI</td>
			<td style="width:147px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H1200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ribonucleoside-vanadyl complex</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">S1402S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Illustra MicroSpin G-50 Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">27-5330-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">5424</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Forceps</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">300-050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:147px;">Bioexpress</td>
			<td style="width:119px;">C-3262-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Cytospin 3</td>
			<td style="width:147px;">Shandon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Coplin jar</td>
			<td style="width:147px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-815</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost /Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-well dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-566-301</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover glass&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-544-G</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:297px;">Air incubator</td>
			<td style="width:147px;">Revolutionary Science</td>
			<td style="width:119px;">RS-IF-203</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells

Testis germ hücre farklılaşması sırasında nükleer kromatin yapısı dinamik olarak değişir. Aşağıda, farelerde bulunan testis germ hücrelerinin üç boyutlu kromatin düzenini korumak için tasarlanmış bir yöntem açıklanmaktadır; bu yöntem üç boyutlu (3D) slayt yöntemi olarak ad verilmiştir. Bu yöntemde, testis tübülleri doğrudan sitoplazmik malzemeyi uzaklaştıran bir permeabilizasyon adımı ve ardından nükleer malzemeleri düzelten bir fiksasyon adımı ile muamele edilir. Tübüller daha sonra ayrışır, hücre süspansiyonu sitospundur ve hücreler slaytlara yapışır. Bu yöntem subnükleer yapıların saptanmasında hassasiyeti artırır ve immünoresans, DNA ve RNA floresan in situ hibridizasyon (FISH) ve bu tespit yöntemlerinin kombinasyonu için geçerlidir. 3D slayt yönteminin olası bir uygulamasına örnek olarak, nascent RNA'ları algılamak için bir Cot-1 RNA FISH gösterilir. 3D slayt yöntemi, testis germ hücre farklılaşması sırasında kromatin yapısı, DNA ve RNA arasındaki mekansal ilişkilerin ayrıntılı olarak incelenmesini kolaylaştıracaktır.

3D slaydın temsili bir sonucu Şekil 2'de gösterilir. Bu deneyde Cot-1 RNA FISH, anti CBX1 ve φH2AX antikorları kullanılarak immünostaining ile birlikte nascent transkripsiyonunu tespit etmek için gerçekleştirildi. RNA FISH ve immünostaining'i birleştirmek için önce immünostaining yapıldı, ardından3'teaçıklandığı gibi RNA FISH . CBX1, XY vücudu (veya seks vücudu) adı verilen meiosisteki perisantronerik heterokromatin ve sessiz cinsiyet kromozomlarına lokalize olan bir...

Watch this Scientific Journal Video about Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells at JoVE.com

Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells

Testis Germ Hücrelerinin Üç Boyutlu Kromatin Mimarisini Korumak için Slayt Hazırlama Yöntemi

Buradaki materyal testis germ hücrelerinin üç boyutlu kromatin yapısını korumak için geliştirilen bir yöntemi açıklamaktadır. Bu, üç boyutlu (3D) slayt yöntemi olarak ad verilmiştir. Bu yöntem subnükleer yapıların tespiti için hassasiyeti artırır ve immünoresans, DNA ve RNA floresan in situ hibridizasyon (FISH) için geçerlidir.

During testicular germ cell differentiation, the structure of nuclear chromatin dynamically changes. The following describes a method designed to preserve ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Üç boyutlu Hücre ekimi için Chip-ölçekli Yapı iskeleleri mikroimalat

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

Hi-C: genomların Üç boyutlu Mimari Eğitim Bir Yöntem.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

Üç boyutlu Karışık-hücre Sfero Co-kültürden Meme Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Testis Hücre Cezalı Hazırlanması için basit ve Verimli Tekniği

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Germ benzeri hücreler içine Yenidoğan Fare Cilt Türetilmiş Kök Hücre Farklılaşma<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

Tüm montaj ovüllerindeki in Kromatin Modifikasyonu ve Nükleer Mimarlık Kantitatif, Tek hücreli Analizi için Etkin Bir Yöntem<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Üç boyutlu Hidrojeller içinde Görüntüleme FRET

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

Pasif AÇIKLIĞI temizlenmiş Mouse ovarium vasküler mimarisinin üç boyutlu yeniden yapılandırma

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-Clear: Bir doku Yöntem yağ dokusu üç boyutlu görüntüleme için temizlenmesi

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Bozulmamış Organoidlerin Tek Hücreli Çözünürlükte Üç Boyutlu Görüntülemesi

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...