Name: assays for the identification of novel antivirals against bluetongue virus
Uploaded: 2013-10-11T23:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus at JoVE.com

Ce projet a été financée par la subvention 1R03MH08127-01 et 7R03MH08127-02 du NIH à Q. Li, et par les fonds d&#39;IMPACT du Département de médecine de l&#39;UAB à Q. Li. Le soutien du Fonds Molette et l&#39;Université d&#39;Auburn est appréciée. Nous remercions également les aides techniques de Mme Pulin Che et M. Volodymyr Musiienko au cours des travaux.

Une. Cellules, virus et les composés antiviraux <ol><li> Maintenir les cellules BSR, un dérivé de rein de bébé hamster (BHK), les cellules 10 dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant 5% de sérum de veau foetal (FCS), 100U/ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine. </li><li> Pour les trois essais, les cellules de la plaque dans du DMEM avec 1% de FCS, 100U/ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine, comme précédemment optimisés 5. Ce milieu est dési...

<ol>
	<li>Hemati, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bluetongue+virus+targets+conventional+dendritic+cells+in+skin+lymph.">Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph.</a> J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Virostatic+Agents+against+Bluetongue+Virus.">Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus.</a> PLoS ONE. 7, e43341 (2012).</li><li>Meiswinkel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2006+outbreak+of+bluetongue+in+northern+Europe--the+entomological+perspective.">The 2006 outbreak of bluetongue in northern Europe--the entomological perspective.</a> Prev. Vet. Med. 87, 55-63 (2008).</li><li>Szmaragd, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mortality+and+case+fatality+during+the+recurrence+of+BTV-8+in+northern+Europe+in+2007.">Mortality and case fatality during the recurrence of BTV-8 in northern Europe in 2007.</a> Vet. Rec. 161, 571-572 (2007).</li><li>Li, Q., Maddox, C., Rasmussen, L., Hobrath, J. V., White, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+development+and+high+throughput+antiviral+drug+screening+against+Bluetongue+virus.">Assay development and high throughput antiviral drug screening against Bluetongue virus.</a> Antiviral Research. 83, 267-273 (2009).</li><li>Noah, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+luminescence+assay+is+effective+for+high-throughput+screening+of+potential+influenza+antivirals.">A cell-based luminescence assay is effective for high-throughput screening of potential influenza antivirals.</a> Antiviral Res. 73, 50-59 (2007).</li><li>Che, P., Wang, L., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development,+optimization+and+validation+of+an+assay+for+high+throughput+antiviral+drug+screening+against+Dengue+virus.">The development, optimization and validation of an assay for high throughput antiviral drug screening against Dengue virus.</a> Int. J. Clin. Exp. Med. 2, 363-373 (2009).</li><li>Li, Q., Li, H., Blitvich, B. J., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aedes+albopictus+inhibitor+of+apoptosis+1+gene+protects+vertebrate+cells+from+bluetongue+virus-induced+apoptosis.">The Aedes albopictus inhibitor of apoptosis 1 gene protects vertebrate cells from bluetongue virus-induced apoptosis.</a> Insect Mol. Biol. 16, 93-105 (2007).</li><li>Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+MTT+and+ATP-based+assays+for+the+measurement+of+viable+cell+number.">Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell number.</a> J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).</li><li>Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. 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Virol. 73, 251-259 (1999).</li><li>Phillips, T., Jenkinson, L., McCrae, C., Thong, B., Unitt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+high-throughput+human+rhinovirus+infectivity+cell-based+assay+for+identifying+antiviral+compounds.">Development of a high-throughput human rhinovirus infectivity cell-based assay for identifying antiviral compounds.</a> J. Virol. Methods. 173, 182-188 (2011).</li><li>Harvey, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetracycline-inducible+packaging+cell+line+for+production+of+flavivirus+replicon+particles.">Tetracycline-inducible packaging cell line for production of flavivirus replicon particles.</a> J. Virol. 78, 531-538 (2004).</li><li>Puig-Basagoiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+assays+using+a+luciferase-expressing+replicon,+virus-like+particles,+and+full-length+virus+for+West+Nile+virus+drug+discovery.">High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 4980-4988 (2005).</li><li>Puig-Basagoiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triaryl+pyrazoline+compound+inhibits+flavivirus+RNA+replication.">Triaryl pyrazoline compound inhibits flavivirus RNA replication.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 50, 1320-1329 (2006).</li><li>Duan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+protection+against+the+highly+pathogenic+H5N1+influenza+virus+by+an+antisense+phosphorothioate+oligonucleotide.">In vitro and in vivo protection against the highly pathogenic H5N1 influenza virus by an antisense phosphorothioate oligonucleotide.</a> Antivir. Ther. 13, 109-114 (2008).</li><li>Ray, D., Shi, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+flavivirus+antiviral+drug+discovery+and+vaccine+development.">Recent advances in flavivirus antiviral drug discovery and vaccine development.</a> Recent Pat. Antiinfect. Drug Discov. 1, 45-55 (2006).</li><li>Severson, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+a+100,000-compound+library+for+inhibitors+of+influenza+A+virus+(H3N2).">High-throughput screening of a 100,000-compound library for inhibitors of influenza A virus (H3N2).</a> J. Biomol. Screen. 13, 879-887 (2008).</li><li>Severson, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+high-throughput+screen+for+inhibitors+of+SARS+CoV+and+its+application+in+screening+of+a+100,000-compound+library.">Development and validation of a high-throughput screen for inhibitors of SARS CoV and its application in screening of a 100,000-compound library.</a> J. Biomol. Screen. 12, 33-40 (2007).</li><li>Bolken, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+potent+small+molecule+inhibitor+of+hemorrhagic+fever+New+World+arenaviruses.">Identification and characterization of potent small molecule inhibitor of hemorrhagic fever New World arenaviruses.</a> Antivir. Res. 69, 86-97 (2006).</li><li>Van Loock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-throughput+cellular+screening+assay+for+the+discovery+of+HIV-1+integrase+inhibitors.">A novel high-throughput cellular screening assay for the discovery of HIV-1 integrase inhibitors.</a> J. Virol. Methods. 179, 396-401 (2012).</li><li>Kampmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+screening+of+small+molecule+libraries+using+the+dengue+virus+envelope+E+protein+has+identified+compounds+with+antiviral+activity+against+multiple+flaviviruses.">In silico screening of small molecule libraries using the dengue virus envelope E protein has identified compounds with antiviral activity against multiple flaviviruses.</a> Antiviral Res. 84, 234-241 (2009).</li><li>Kirchmair, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+anti-viral+agents+using+molecular+modeling+and+virtual+screening+techniques.">Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques.</a> Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).</li></ol>

Pour l&#39;identification initiale des résultats antiviraux, l&#39;une des étapes clés pour la découverte de médicaments antiviraux et de développement est de développer des tests robustes, qui comprend la sélection d&#39;un marqueur quantifiable, l&#39;élaboration d&#39;un protocole simple, obtenir suffisamment de signaux et moins de 10% CV. La plupart des écrans biochimiques ou cellulaires sont conçus pour fournir un point de départ chimique sur la base du plus robuste, un test simple et peu coûteux, en r...

BTV est un virus à ARN double brin prototype dans le genre Orbivirus, famille Reoviridae. BTV est une des maladies les plus importantes de bétail domestique, y compris les ovins, les caprins, les bovins et d&#39;autres animaux domestiques, avec une perte $ 3000000000 / année dans le monde 1,2. Le sérotype BTV exotique est un agent pathogène important animale énumérés dans les &quot;USDA Haute Conséquence agents pathogènes du bétail.&quot; Récemment, la ré-émergentes de BTV a causé une épidémie majeure de la maladie chez les bovins et les moutons dans plusieurs pays d&#39;Europe du Nord 3,4. En raison de son importance économique et en tant que système modèle, BTV a fait l&#39;objet d&#39;études moléculaires, génétiques et structurales étendues, et plusieurs vaccins ont été mis au point. Toutefois, en raison de l&#39;absence de tests adéquats pour la découverte de médicaments antiviraux, il n&#39;y a pas d&#39;antiviraux disponibles contre la maladie. Dans un récent criblage à haut débit (HTS) de la campagne en utilisant BTV comme système modèle, nous Developed, optimisé et validé un test basé sur CPE à identifier des antiviraux à large spectre contre les arbovirus potentiels 5. Dosage à base de CPE est un test bien connu qui a été utilisé dans la découverte de médicaments antiviraux contre un certain nombre de virus qui induit rapide et observable CPE / apoptose 5-7. Dans notre système, après l&#39;infection virale, CPE est évident dans les cellules de vertébrés, y compris les cellules HeLa, BSR, et HEK 293T 8. CPE BTV-induite peut être surveillée et quantifiée à l&#39;aide de divers procédés de détection de la viabilité cellulaire, y compris le kit de réactifs de viabilité cellulaire CellTiter Glo (kit CTG) 9. Cet ensemble détermine le nombre de cellules viables dans la culture sur la base de la quantification de l&#39;ATP cellulaire présenté, ce qui signale la présence de cellules vivantes métaboliquement actives. Dans des conditions optimisées, le dosage à base de CPE-présentée ici a montré sa faisabilité avec le &quot;mélanger et mesurer&quot; protocole en une étape, et la flexibilité avec des signaux luminescents stables. Pendant ce temps, les composés toxiques Reducement viabilité cellulaire sera exclu de cette analyse à base de CPE. Le dosage à base de CPE-a montré sa robustesse et sa fiabilité pour antivirale découverte de médicaments contre la maladie, et a été utilisé pour cribler des bibliothèques moléculaires référentiel NIH petites molécules (MLSMR), ce qui conduit à l&#39;identification de six nouveaux groupe de potentiel antiviral composé de plomb (s ) 5. Quand un composé antiviral potentiel a été identifié en utilisant l&#39;essai à base de CPE, il devra être soumis à l&#39;essai dose-réponse dix-concentration pour déterminer la plage d&#39;efficacité antivirale et la cytotoxicité 2. L&#39;efficacité antivirale, représentée comme la concentration inhibitrice 50% (CI 50), soit la concentration efficace 50% (EC50) est la concentration d&#39;un médicament qui inhibe la CPE à mi-chemin viro-induite entre la ligne de base et au maximum. La cytotoxicité des antiviraux, c&#39;est à dire la concentration de la cytotoxicité de 50% (CC 50), est la concentrationd&#39;un médicament induisant une cytotoxicité de 50% entre la ligne de base et au maximum. L&#39;indice sélectif (SI), noté 50% SI (SI 50) est calculée à partir de CC 50 / IC 50 qui détermine la spécificité de la antivirale contre le CPE induit par un virus. La CI 50 (ou 50 CE), CC 50 et SI 50 valeurs sont des mesures essentielles pour déterminer si un composé antiviral est puissant et sélectif pour la poursuite du développement de médicaments. Quand un antiviral n&#39;a montré aucune toxicité manifeste in vitro, encore empêché virus induit CPE et le cycle de vie virale productive, il est important de caractériser son mode d&#39;action 2. Nous avons lancé cette qualification en réalisant essai ToA pour déterminer l&#39;étape possible (s) de cycle de vie viral qui est affecté par l&#39;antiviral. En général, composé antiviral ont été ajoutés à des cellules à différents moments pré-ou post-infection virus. Si les antiviraux ont été ajoutés à des cellules infectées poster à son objectif detep au cours de l&#39;infection, il en résulterait une activité plus faible par rapport à celle qui a été ajoutée avant l&#39;étape. Ainsi, l&#39;étude ToA est critique pour la détermination de l&#39;efficacité antivirale d&#39;un composé, et sa cible potentielle, soit sur le cycle de vie viral ou la machinerie de l&#39;hôte impliquées dans le cycle de vie viral. Pour les trois essais, la viabilité cellulaire a été déterminée en utilisant le kit CTG suivant les instructions du fabricant 5. Ce système de détection émet des signaux de luminescence adéquates qui pourraient être analysés à l&#39;aide de divers logiciels en interne. Chaque essai a été validé et effectué au moins en triple exemplaire avec huit répliques. Pour l&#39;ensemble des données obtenues, trois paramètres, y compris la valeur moyenne (AVE), l&#39;écart type (STDEV), et coefficient de variation (CV) ont été analysés afin de déterminer la robustesse de l&#39;analyse. Une fois la robustesse de l&#39;analyse a été déterminé, les données seront analysés et obtenues en utilisant différents biostatistique et graphiquementdes outils de c 2.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1134218</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1000185</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gbico</td>
			<td>1049769</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo (CTG) kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>TB288</td>
			<td>For cell viability measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S25309B</td>
			<td>Diluted from 95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antiviral huashilcompounds</td>
			<td>NIH MLSMR and de novo synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTV-10</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSR cell</td>
			<td>Developed in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy-II multi-mode microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>For luminescent signal reading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroFlo select dispenser</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>Adding cells, virus, and reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well flat-bottom microplate</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>28908031</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen. 5 software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 5</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Version 5</td>
			<td>For biostatic analysis and plot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for the identification of novel antivirals against bluetongue virus

Pour identifier les antiviraux potentiels contre BTV, nous avons développé, optimisé et validé trois essais présentés ici. L&#39;essai à base de CPE-a été le premier essai mis au point pour évaluer si un composé a montré une quelconque efficacité antivirale et ont été utilisés pour cribler grande bibliothèque de composés. Pendant ce temps, la cytotoxicité des antiviraux pourrait également être évaluée en utilisant le test basé CPE. L&#39;analyse dose-réponse a été conçu pour déterminer la plage de l&#39;efficacité de l&#39;antiviral choisi, c&#39;est à dire 50% de la concentration inhibitrice (CI 50) ou la concentration efficace (CE 50), ainsi que sa gamme de cytotoxicité (CC 50). Le dosage ToA a été utilisée pour l&#39;étude initiale MoA pour déterminer le mécanisme sous-jacent des nouveaux antiviraux pendant BTV cycle de vie viral ou l&#39;effet possible sur la machinerie cellulaire de l&#39;hôte. Ces dosages sont vitales pour l&#39;évaluation de l&#39;efficacité antivirale dans un système de culture cellulaire, et ont été utilisés pour conduire nos recherches récentesment à l&#39;identification d&#39;un certain nombre de nouveaux antiviraux contre BTV.

Une. Efficacité antivirale du composé Le dosage de la CPE à base de cellules a été développé, optimisé et validé in vitro en utilisant le kit CTG base luminescente à identifier de nouveaux antiviraux contre la maladie, comme décrit précédemment 2,5. Le dosage de la réponse dix-dose a été utilisée pour tenir compte de l&#39;efficacité antivirale et la cytotoxicité d&#39;un composé de plomb identifiés en mesurant le nombre de cellules métaboliquement viab...

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Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Trois essais, y compris l&#39;effet cytopathique (CPE) à base de test, essai dose-réponse et (TOA) test à temps de Addition ont été développés, optimisés, validés et utilisés pour identifier de nouveaux antiviraux contre le virus de la fièvre catarrhale (BTV), ainsi à déterminer le Mécanisme d&#39;action-de-possible (MOA) pour antiviraux nouvellement identifiés.

Les tests pour l&#39;identification de nouveaux antiviraux contre la fièvre catarrhale Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

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