Name: assays for the identification of novel antivirals against bluetongue virus
Uploaded: 2013-10-11T23:00:00
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Questo progetto è stato sostenuto dalla concessione 1R03MH08127-01 e 7R03MH08127-02 dal NIH per Q. Li, e dai fondi IMPACT dal Dipartimento di Medicina a UAB di Q. Li. Il sostegno del Fondo Molette e Auburn University è apprezzato. Ringraziamo anche le assistenze tecniche da Ms. Pulin Che e Mr. Volodymyr Musiienko durante il corso dei lavori.

1. Le cellule, virus e antivirale Compounds <ol><li> Mantenere cellule BSR, un derivato di criceto neonato (BHK) rene alveoli 10, in mezzo di Eagle modificato da Dulbecco (DMEM) contenente siero fetale di vitello al 5% (FCS), 100U/ml penicillina e 100 pg / ml streptomicina. </li><li> Per tutti e tre saggi, cellule piastra in DMEM con 1% FCS, 100U/ml penicillina e 100 pg / ml streptomicina, ottimizzata in precedenza 5. Questo mezzo è indicato come terreno di coltura per tutti e tre saggi. </li><l...

<ol>
	<li>Hemati, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bluetongue+virus+targets+conventional+dendritic+cells+in+skin+lymph.">Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph.</a> J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Virostatic+Agents+against+Bluetongue+Virus.">Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus.</a> PLoS ONE. 7, e43341 (2012).</li><li>Meiswinkel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2006+outbreak+of+bluetongue+in+northern+Europe--the+entomological+perspective.">The 2006 outbreak of bluetongue in northern Europe--the entomological perspective.</a> Prev. Vet. Med. 87, 55-63 (2008).</li><li>Szmaragd, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mortality+and+case+fatality+during+the+recurrence+of+BTV-8+in+northern+Europe+in+2007.">Mortality and case fatality during the recurrence of BTV-8 in northern Europe in 2007.</a> Vet. Rec. 161, 571-572 (2007).</li><li>Li, Q., Maddox, C., Rasmussen, L., Hobrath, J. V., White, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+development+and+high+throughput+antiviral+drug+screening+against+Bluetongue+virus.">Assay development and high throughput antiviral drug screening against Bluetongue virus.</a> Antiviral Research. 83, 267-273 (2009).</li><li>Noah, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+luminescence+assay+is+effective+for+high-throughput+screening+of+potential+influenza+antivirals.">A cell-based luminescence assay is effective for high-throughput screening of potential influenza antivirals.</a> Antiviral Res. 73, 50-59 (2007).</li><li>Che, P., Wang, L., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development,+optimization+and+validation+of+an+assay+for+high+throughput+antiviral+drug+screening+against+Dengue+virus.">The development, optimization and validation of an assay for high throughput antiviral drug screening against Dengue virus.</a> Int. J. Clin. Exp. Med. 2, 363-373 (2009).</li><li>Li, Q., Li, H., Blitvich, B. J., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aedes+albopictus+inhibitor+of+apoptosis+1+gene+protects+vertebrate+cells+from+bluetongue+virus-induced+apoptosis.">The Aedes albopictus inhibitor of apoptosis 1 gene protects vertebrate cells from bluetongue virus-induced apoptosis.</a> Insect Mol. Biol. 16, 93-105 (2007).</li><li>Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+MTT+and+ATP-based+assays+for+the+measurement+of+viable+cell+number.">Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell number.</a> J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).</li><li>Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. 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Virol. 78, 531-538 (2004).</li><li>Puig-Basagoiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+assays+using+a+luciferase-expressing+replicon,+virus-like+particles,+and+full-length+virus+for+West+Nile+virus+drug+discovery.">High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 4980-4988 (2005).</li><li>Puig-Basagoiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triaryl+pyrazoline+compound+inhibits+flavivirus+RNA+replication.">Triaryl pyrazoline compound inhibits flavivirus RNA replication.</a> Antimicrob. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+a+100,000-compound+library+for+inhibitors+of+influenza+A+virus+(H3N2).">High-throughput screening of a 100,000-compound library for inhibitors of influenza A virus (H3N2).</a> J. Biomol. Screen. 13, 879-887 (2008).</li><li>Severson, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+high-throughput+screen+for+inhibitors+of+SARS+CoV+and+its+application+in+screening+of+a+100,000-compound+library.">Development and validation of a high-throughput screen for inhibitors of SARS CoV and its application in screening of a 100,000-compound library.</a> J. Biomol. Screen. 12, 33-40 (2007).</li><li>Bolken, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+potent+small+molecule+inhibitor+of+hemorrhagic+fever+New+World+arenaviruses.">Identification and characterization of potent small molecule inhibitor of hemorrhagic fever New World arenaviruses.</a> Antivir. Res. 69, 86-97 (2006).</li><li>Van Loock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-throughput+cellular+screening+assay+for+the+discovery+of+HIV-1+integrase+inhibitors.">A novel high-throughput cellular screening assay for the discovery of HIV-1 integrase inhibitors.</a> J. Virol. Methods. 179, 396-401 (2012).</li><li>Kampmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+screening+of+small+molecule+libraries+using+the+dengue+virus+envelope+E+protein+has+identified+compounds+with+antiviral+activity+against+multiple+flaviviruses.">In silico screening of small molecule libraries using the dengue virus envelope E protein has identified compounds with antiviral activity against multiple flaviviruses.</a> Antiviral Res. 84, 234-241 (2009).</li><li>Kirchmair, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+anti-viral+agents+using+molecular+modeling+and+virtual+screening+techniques.">Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques.</a> Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).</li></ol>

Per l&#39;identificazione iniziale di colpi antivirali, uno dei passaggi chiave per la scoperta di farmaci antivirali e di sviluppo è quello di sviluppare analisi robuste, che prevede la selezione di un indicatore quantificabile, lo sviluppo di un protocollo semplice, ottenendo segnali sufficienti e meno del 10% CV. Quasi tutte le schermate biochimiche o basati su cellule sono progettati per fornire un punto di partenza chimica basato sulla più robusta, semplice e poco costoso saggio, causa la riproducibilità richies...

BTV è un prototipo di virus a RNA a doppio filamento in genere Orbivirus, famiglia Reoviridae. BTV è una delle malattie più importanti del bestiame domestico, tra cui ovini, caprini, bovini e altri animali domestici, con la perdita di 3.000 milioni dollari / anno nel mondo 1,2. La BTV sierotipo esotico è un importante patogeno animale elencati nella sezione &quot;USDA alta Consequence Bestiame patogeni.&quot; Recentemente, il riemergere di BTV ha causato una grave focolaio di malattia in bovini e ovini in diversi paesi in tutto il Nord Europa 3,4. Come risultato della sua rilevanza economica e come sistema modello, BTV è stato oggetto di approfonditi studi molecolari, genetici e strutturali, e sono stati sviluppati diversi vaccini. Tuttavia, a causa della mancanza di test adeguati per la scoperta di farmaci antivirali, non ci sono disponibili antivirali contro BTV. In un recente screening ad alto rendimento (HTS) campagna usando BTV come sistema modello, Developed, ottimizzato e convalidato un saggio basato CPE-per identificare i potenziali antivirali ad ampio spettro contro arbovirus 5. Saggio basato CPE-è un saggio ben riconosciuto che è stato usato nella scoperta di farmaci antivirali contro una serie di virus che ha indotto un rapido e osservabile CPE / apoptosi 5-7. Nel nostro sistema, infezioni post BTV, CPE è evidente nelle cellule dei vertebrati, tra cui HeLa, BSR, e HEK 293T 8. CPE BTV-indotta potrebbe essere monitorato e quantificato utilizzando vari metodi di rilevamento vitalità cellulare, compreso il kit di reagenti vitalità cellulare CellTiter Glo (kit CTG) 9. Questo kit determina il numero di cellule vitali in coltura a base di quantificazione di ATP cellulare presentato, che segnala la presenza di cellule viventi metabolicamente attive. In condizioni ottimali, il saggio basato CPE-qui presentato ha dimostrato la sua fattibilità con il protocollo di un passo &quot;mix e misura&quot;, e la flessibilità con i segnali luminescenti stabili. Nel frattempo, composti tossici riduziamento vitalità cellulare sarà escluso in questo saggio basato CPE. Il saggio basato CPE-ha mostrato la sua robustezza e affidabilità per la scoperta di farmaci antivirali contro BTV, ed è stato utilizzato per schermare il NIH molecolare Biblioteche Piccolo Molecola Repository (MLSMR), che porta alla identificazione di sei romanzo gruppo di potenziali lead compound antivirale (s ) 5. Quando un composto antivirale potenziale è stato identificato utilizzando il saggio basato CPE-, esso dovrà essere sottoposto al dieci concentrazione dosaggio dose-risposta per determinare l&#39;intervallo di efficacia antivirale e citotossicità 2. L&#39;efficacia antivirale, rappresentata come la concentrazione inibitoria del 50% (IC 50) o la concentrazione efficace 50% (EC 50), è la concentrazione di un farmaco che inibisce virus-indotto CPE metà strada tra la linea di base e massimo. La citotossicità dei farmaci antivirali, cioè la concentrazione citotossicità 50% (CC 50), è la concentrazionedi un farmaco che induce il 50% di citotossicità tra la linea base e massimo. L&#39;indice selettivo (SI), indicato come 50% SI (SI 50) è calcolata da CC 50 / IC 50 che determina la specificità del CPE antivirale contro virus-indotta. L&#39;IC 50 (o 50 CE), CC 50 e SI 50 valori sono misure fondamentali per determinare se un composto antivirale è potente e selettivo per l&#39;ulteriore sviluppo della droga. Quando un antivirale ha mostrato alcuna tossicità manifesta in vitro, ma virus impedito indotto CPE e il ciclo di vita virale produttiva, è importante per determinarne la MoA 2. Abbiamo avviato tale caratterizzazione effettuando test ToA per determinare l&#39;eventuale fase (s) di virale ciclo di vita che è influenzata dal antivirale. In generale, composto antivirale sono stati aggiunti alle cellule in diversi momenti pre-o post-infezione da virus. Se gli antivirali sono stati aggiunti alle cellule infettate rispondere alla sua destinazione step durante il corso dell&#39;infezione, ne risulterebbe minore attività rispetto a quella che è stata aggiunta prima della fase. Così, studio ToA è critica per determinare l&#39;efficacia di un composto antivirale, e il suo potenziale bersaglio, sia sul ciclo di vita virale o della macchina ospitante coinvolti nel ciclo di vita virale. Per tutti e tre saggi, la vitalità cellulare è stata determinata utilizzando il kit CTG seguenti istruzioni del produttore 5. Questo sistema di rilevamento emette adeguati segnali di luminescenza che potrebbero essere analizzate utilizzando i vari software in-house. Ogni test è stato convalidato ed eseguito in almeno tre esemplari con otto repliche. Per tutti i dati ottenuti, tre parametri, con un valore medio (AVE), deviazione standard (DEVST), e coefficiente di variazione (CV) sono stati analizzati per determinare la robustezza del dosaggio. Una volta che la robustezza del saggio è stata determinata, i dati saranno ulteriormente analizzati e tracciati utilizzando vari biostatics e graficamentestrumenti di C 2.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1134218</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1000185</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gbico</td>
			<td>1049769</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo (CTG) kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>TB288</td>
			<td>For cell viability measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S25309B</td>
			<td>Diluted from 95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antiviral huashilcompounds</td>
			<td>NIH MLSMR and de novo synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTV-10</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSR cell</td>
			<td>Developed in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy-II multi-mode microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>For luminescent signal reading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroFlo select dispenser</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>Adding cells, virus, and reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well flat-bottom microplate</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>28908031</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen. 5 software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 5</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Version 5</td>
			<td>For biostatic analysis and plot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for the identification of novel antivirals against bluetongue virus

Per identificare potenziali farmaci antivirali contro il BTV, abbiamo sviluppato, ottimizzato e validato tre saggi qui presentati. Il saggio basato CPE-è stato il primo test sviluppato per valutare se un composto ha mostrato alcuna efficacia antivirale e sono stati utilizzati per lo screening grande libreria di composti. Nel frattempo, la citotossicità di farmaci antivirali potrebbe anche essere valutata utilizzando il saggio basato CPE-. Il dosaggio dose-risposta è stato progettato per determinare il campo di efficacia per l&#39;antivirale prescelto, cioè il 50% della concentrazione inibente (IC 50) o la concentrazione effettiva (EC 50), così come la sua gamma di citotossicità (CC 50). Il saggio ToA è stato impiegato per lo studio iniziale MoA per determinare il meccanismo alla base dei nuovi farmaci antivirali durante il ciclo di vita virale del virus o il possibile effetto su un host macchinario cellulare. Questi test sono essenziali per la valutazione dell&#39;efficacia antivirale nel sistema di coltura cellulare, e sono stati utilizzati per le nostre ricerche recenti portarezione per l&#39;identificazione di una serie di nuovi farmaci antivirali contro il BTV.

1. Efficacia antivirale del composto Il saggio CPE a base di cellule è stato sviluppato, ottimizzato e validato in vitro utilizzando il kit CTG basata luminescenti a identificare nuovi farmaci antivirali contro BTV come descritto in precedenza 2,5. Il test di risposta ten-dose è stata impiegata per riflettere l&#39;efficacia antivirale e citotossicità di un composto guida identificato misurando il numero di cellule metabolicamente vitali in coltura a base di quantificazio...

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Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Tre saggi, tra cui l&#39;effetto citopatico (CPE) a base di test, analisi dose-risposta e Time-of-Addition (ToA) test sono stati sviluppati, ottimizzati, validati ed utilizzati per identificare nuovi farmaci antivirali contro il virus della Bluetongue (BTV), nonché per determinare il meccanismo d&#39;azione possibile (MOA) per i farmaci antivirali di nuova identificazione.

Saggi per l&#39;individuazione di nuovi antivirali contro virus della Bluetongue

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

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