Name: assays for the identification of novel antivirals against bluetongue virus
Uploaded: 2013-10-11T23:00:00
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이 프로젝트는 보조금 1R03M​​H08127-01와 NIH에서 Q. 리튬에 7R03MH08127-02에서 지원하고, UAB에서 의학 교실에서 충격의 펀드 Q. 리 하였다. Molette 기금 오번 대학에서 지원을 받고있다. 우리는 또한 작업 과정에서 양 Pulin 최 씨 블라디미르 Musiienko의 기술 조교 감사합니다.

1. 셀, 바이러스 및 항 바이러스 화합물 <ol><li> BSR 세포, 5 % 소 태아 혈청 (FCS)를 포함하는 아기 햄스터 신장의 파생 둘 베코의 변형 이글 배지 (BHK) 세포를 10 일 (DMEM)을 유지, 100U/ml 페니실린 및 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신. </li><li> 세 가지 분석을 위해, 1 % FCS, 100U/ml 페니실린 및 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신과 DMEM에 플레이트 세포, 5는 이전 최적화로. 이 매체는 세 가지 분석을위?...

<ol>
	<li>Hemati, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bluetongue+virus+targets+conventional+dendritic+cells+in+skin+lymph.">Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph.</a> J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Virostatic+Agents+against+Bluetongue+Virus.">Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus.</a> PLoS ONE. 7, e43341 (2012).</li><li>Meiswinkel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2006+outbreak+of+bluetongue+in+northern+Europe--the+entomological+perspective.">The 2006 outbreak of bluetongue in northern Europe--the entomological perspective.</a> Prev. Vet. Med. 87, 55-63 (2008).</li><li>Szmaragd, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mortality+and+case+fatality+during+the+recurrence+of+BTV-8+in+northern+Europe+in+2007.">Mortality and case fatality during the recurrence of BTV-8 in northern Europe in 2007.</a> Vet. Rec. 161, 571-572 (2007).</li><li>Li, Q., Maddox, C., Rasmussen, L., Hobrath, J. V., White, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+development+and+high+throughput+antiviral+drug+screening+against+Bluetongue+virus.">Assay development and high throughput antiviral drug screening against Bluetongue virus.</a> Antiviral Research. 83, 267-273 (2009).</li><li>Noah, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+luminescence+assay+is+effective+for+high-throughput+screening+of+potential+influenza+antivirals.">A cell-based luminescence assay is effective for high-throughput screening of potential influenza antivirals.</a> Antiviral Res. 73, 50-59 (2007).</li><li>Che, P., Wang, L., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development,+optimization+and+validation+of+an+assay+for+high+throughput+antiviral+drug+screening+against+Dengue+virus.">The development, optimization and validation of an assay for high throughput antiviral drug screening against Dengue virus.</a> Int. J. Clin. Exp. Med. 2, 363-373 (2009).</li><li>Li, Q., Li, H., Blitvich, B. J., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aedes+albopictus+inhibitor+of+apoptosis+1+gene+protects+vertebrate+cells+from+bluetongue+virus-induced+apoptosis.">The Aedes albopictus inhibitor of apoptosis 1 gene protects vertebrate cells from bluetongue virus-induced apoptosis.</a> Insect Mol. Biol. 16, 93-105 (2007).</li><li>Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+MTT+and+ATP-based+assays+for+the+measurement+of+viable+cell+number.">Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell number.</a> J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).</li><li>Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+potent+small+molecule+inhibitor+of+hemorrhagic+fever+New+World+arenaviruses.">Identification and characterization of potent small molecule inhibitor of hemorrhagic fever New World arenaviruses.</a> Antivir. Res. 69, 86-97 (2006).</li><li>Van Loock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-throughput+cellular+screening+assay+for+the+discovery+of+HIV-1+integrase+inhibitors.">A novel high-throughput cellular screening assay for the discovery of HIV-1 integrase inhibitors.</a> J. Virol. Methods. 179, 396-401 (2012).</li><li>Kampmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+screening+of+small+molecule+libraries+using+the+dengue+virus+envelope+E+protein+has+identified+compounds+with+antiviral+activity+against+multiple+flaviviruses.">In silico screening of small molecule libraries using the dengue virus envelope E protein has identified compounds with antiviral activity against multiple flaviviruses.</a> Antiviral Res. 84, 234-241 (2009).</li><li>Kirchmair, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+anti-viral+agents+using+molecular+modeling+and+virtual+screening+techniques.">Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques.</a> Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).</li></ol>

바이러스 히트 초기 식별, 항 바이러스 약물 발견과 개발을위한 중요한 단계 중 하나는, 정량 가능한 마커를 선택하는 간단한 프로토콜을 개발, 충분한 신호와 10 % 미만의 CV를 획득 포함하는 견고한 분석법을 개발하는 것이다. 대부분의 생화학 적 또는 세포 - 기반 화면 인해 선별 과정에서 필요한 재현성 및 스크리닝하는 분자의 잠재적으로 많은 수의 가장 강력한, 간단하고 저렴한 분석, 기초 화...

BTV는 속 Orbivirus, 가족 Reoviridae에 프로토 타입 이중 가닥 RNA 바이러스이다. BTV는 세계 1,2 30억달러 / 년 손실, 양, 염소, 소와 다른 가축 등 국내 가축의 가장 중요한 질병 중 하나입니다. 이국적인 BTV의 혈청 형에 나열된 중요한 동물 병원체는 &quot;USDA 높은 위험성 평가 가축 병원체.&quot; 최근 다시 부상 BTV의 북부 유럽 3,4에 걸쳐 여러 국가의 주요 가축 질병의 발생과 양을 발생했습니다. 경제적으로 중요한 결과 및 모델 시스템으로서, BTV는 유용한, 분자 유전 학적 및 구조적 연구의 대상이되어 왔으며, 몇몇 백신이 개발되었다. 그러나, 항 바이러스 약물 발견을위한 적합한 분석법의 부족 때문에, BTV 대에는 항 바이러스제는 없다. 모델 시스템으로 BTV를 사용하여 최근의 높은 처리량 검사 (HTS) 캠페인, 우리는 거라고, eveloped 최적화 아르보 바이러스 5에 대한 잠재적 인 광범위한 스펙트럼 항 바이러스를 식별 할 수있는 CPE 기반의 분석을 확인. CPE 기반의 분석은 신속하고 관찰 할 수있는 CPE / 세포 사멸 5-7을 유발 바이러스의 숫자에 대한 항 바이러스 약물 발견에 사용 된 잘 인식 분석이다. 우리의 시스템에서, 포스트 BTV 감염, CPE는 헬라, BSR 및 HEK 293T 8을 포함한 척추 동물의 세포에 분명하다. BTV 유도 CPE는 CellTiter 글로 세포 생존 시약 키트 (CTG 키트) 9를 포함한 다양한 세포 생존 검출 방법을 사용하여 모니터링하고 정량화 할 수있다. 이 키트는 대사 적으로 활성 살아있는 세포의 존재를 신호 셀룰러 ATP의 정량에 기초 문화 가능한 세포의 개수 표시를 결정한다. 최적의 조건에서, 여기에 제시된 CPE 기반의 분석은 &quot;혼합 및 측정&quot;한 단계 프로토콜 및 안정 발광 신호와 유연성의 가능성을 보여 주었다. 한편, 독성 화합물의 redu세포 생존 능력을의 cing은이 CPE 기반 분석에서 제외됩니다. CPE 기반의 분석은 그 견고성과 BTV에 대한 항 바이러스 약물 발견을위한 신뢰성을 보여 잠재적 인 항 바이러스 리드 화합물 (들 여섯 새로운 클러스터의 식별에지도하는 NIH 분자 도서관 작은 분자 저장소 (MLSMR)를 화면에 사용 된 ) 5. 잠재적 인 항 바이러스 화합물을 CPE 기반 분석을 사용하여 확인 된 경우는 항 바이러스 효능 및 독성 2의 범위를 결정하기 위하여 열 - 농도 용량 - 반응 분석을 실시 할 필요가있을 것이다. 항 바이러스 효능은 50 % 억제 농도 (IC 50) 또는 50 % 유효 농도 (EC 50)로 표현,베이스 라인과 최대 사이에 바이러스에 의한 CPE 반 억제하는 약물의 농도이다. 항 바이러스제의 세포 독성은, 50 %의 세포 독성 농도 (CC 50) 즉, 농도는기준선과 최대 사이의 50 % 세포 독성을 유발하는 약물. 50 % SI (SI 50)로 표시 선택적 지수 (SI)는 바이러스에 의한 CPE에 대한 항 바이러스의 특이성을 결정 CC 50 / IC (50)로부터 계산된다. IC 50 (또는 EC 50), CC (50)와 SI (50) 값은 항 바이러스 화합물은 강력하고 더 약물 개발을위한 선택 여부를 확인하는 중요한 조치이다. 항 바이러스가 시험 관내에서 어떠한 명백한 독성을 나타내지 않았다 아직 방지 바이러스 CPE 및 생산성 바이러스 라이프 사이클을 유도 할 때, 그 2 대학교 미술관을 특성화하는 것이 중요하다. 우리는 바이러스에 의해 영향 바이러스 라이프 사이클의 수 단계 (들)를 결정하기 위하여 토아 분석을 수행하여 그러한 특성을 개시. 일반적으로, 항 바이러스 화합물을 상이한 시간 전 또는 후 바이러스 감염시 세포에 첨가 하였다. 항 바이러스가 감염된 세포에 추가 된 경우 그 대상들에 게시이전 단계에 첨가 한 비교하여 TEP 감염 과정 동안, 그것은 낮은 활성을 초래할 것이다. 따라서, 토아 연구는 하나의 바이러스 라이프 사이클 또는 바이러스 성 수명주기에 관여 호스트 기계에, 화합물의 항 바이러스 효능, 그것의 잠재적 인 대상을 결정하는 것이 중요합니다. 세 가지 분석법을 위해, 세포 생존율은 제조업체의 지시에 5 다음 CTG 키트를 사용하여 측정 하였다. 이 검출 시스템은 다양한 내부 소프트웨어를 사용하여 분석 할 수있는 적절한 발광 신호를 출력한다. 각각의 분석은 적어도 8 개의 복제본이 중으로 확인 및 수행 하였다. 모든 콘텐츠 데이터의 경우, 평균값 (AVE), 표준 편차 (STDEV) 및 공동 효율적인 변동 (CV) 등 세 가지 파라미터는, 분석의 견고성을 결정하기 위해 분석 하였다. 분석의 견고성이 결정되면, 데이터가 더 분석하고 다양한 biostatics 및 graphi를 이용하여 나타내 어질 것이다C 공구 2.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1134218</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1000185</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gbico</td>
			<td>1049769</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo (CTG) kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>TB288</td>
			<td>For cell viability measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S25309B</td>
			<td>Diluted from 95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antiviral huashilcompounds</td>
			<td>NIH MLSMR and de novo synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTV-10</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSR cell</td>
			<td>Developed in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy-II multi-mode microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>For luminescent signal reading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroFlo select dispenser</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>Adding cells, virus, and reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well flat-bottom microplate</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>28908031</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen. 5 software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 5</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Version 5</td>
			<td>For biostatic analysis and plot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for the identification of novel antivirals against bluetongue virus

BTV에 대한 잠재적 인 항 바이러스제를 확인하기 위해, 우리는 개발, 최적화 및 여기에 제시된 세 가지 분석을 확인했다. CPE 기반의 분석은 화합물은 항 바이러스 효능을 보여 큰 화합물 라이브러리를 화면으로 사용되었는지 여부를 평가하기 위해 개발 된 최초의 분석이었다. 한편, 항 바이러스의 세포 독성은 CPE 기반 분석을 사용하여 평가 될 수있다. 용량 - 반응 분석을 선택된 바이러스에 대한 효능의 범위를 결정하기 위해 디자인 된, 50 % 억제 농도 (IC 50)이나 유효 농도 (EC 50)뿐만 아니라 세포 독성의 범위 (CC 50) 즉. 토아 분석은 BTV 바이러스 라이프 사이클 또는 호스트 세포 기계에 대한 가능한 영향 동안 새로운 항 바이러스제의 기본 메커니즘을 결정하는 최초의 대학교 미술관의 연구에 사용 하였다. 이러한 분석은 세포 배양 시스템의 항 바이러스 효능을 평가하는데 매우 중요합니다, 우리의 최근의 연구지도를 위해 사용되어왔다BTV에 대한 새로운 항 바이러스제의 숫자의 식별을 보내고.

1. 화합물의 항 바이러스 효능 세포 기반 분석 CPE는, 개발 및 최적화 이전 2,5 바와 같이 BTV 대해 신규 바이러스제를 식별하는 발광 기반 CTG 키트를 사용하여 시험 관내에서 입증되었다. 열 - 투여 량 반응 분석은 살아있는 세포 5,11 제시 세포 ATP의 정량에 기초 문화 대사 생존 세포의 수를 측정함으로써 확인 된 리드 화합물의 항 바이러스 효능 및 독성을 ?...

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Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

세포 변성 효과 (CPE) 기반의 분석, 용량 - 반응 분석 및 시간 - 중 - 추가 TOA () 분석 등의 세 가지 분석은 물론, 개발, 최적화, 검증 및 Bluetongue 바이러스에 대한 새로운 항 바이러스제 (BTV)를 식별하기 위해 사용 된 새로 확인 된 항 바이러스제에 사용할 수있는 기계 장치의 액션 (대학교 미술관)을 결정하기로.

Bluetongue 바이러스에 대한 항 바이러스제 소설의 식별에 대한 분석

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Research

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C 형 간염 바이러스에 대한 인간 락토페린의 세포 흡수 및 관련 바이러스 활동을 모니터링하는 면역 형광

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

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초기 바이러스 성 항목 식별을위한 분석 실험 및 항 바이러스 화합물의 평가

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Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

인간 호중구 유래 거 식세포의 소설 모집단의 개발 및 식별<em&gt; 체외</em

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