Name: assays for the identification of novel antivirals against bluetongue virus
Uploaded: 2013-10-11T23:00:00
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Este projecto foi apoiado pela concessão 1R03MH08127-01 e 7R03MH08127-02 do NIH para Q. Li, e pelos fundos IMPACTO do Departamento de Medicina da UAB para Q. Li. O apoio do Fundo Molette e da Universidade de Auburn é apreciado. Agradecemos também as assistências técnicas de Ms. Pulin Che eo Sr. Volodymyr Musiienko durante o curso do trabalho.

1. Células, vírus e a compostos antivirais <ol><li> Manter células BSR, de um derivado de rim de hamster bebé (BHK), células 10, em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 5% de soro fetal de vitelo (FCS), 100U/ml penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina. </li><li> Para todos os três ensaios, células da placa em DMEM com 1% de FCS, 100U/ml penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina, como anteriormente 5 optimizado. Este meio é referido como meio de ensaio para os três ens...

<ol>
	<li>Hemati, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bluetongue+virus+targets+conventional+dendritic+cells+in+skin+lymph.">Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph.</a> J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Virostatic+Agents+against+Bluetongue+Virus.">Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus.</a> PLoS ONE. 7, e43341 (2012).</li><li>Meiswinkel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2006+outbreak+of+bluetongue+in+northern+Europe--the+entomological+perspective.">The 2006 outbreak of bluetongue in northern Europe--the entomological perspective.</a> Prev. Vet. Med. 87, 55-63 (2008).</li><li>Szmaragd, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mortality+and+case+fatality+during+the+recurrence+of+BTV-8+in+northern+Europe+in+2007.">Mortality and case fatality during the recurrence of BTV-8 in northern Europe in 2007.</a> Vet. Rec. 161, 571-572 (2007).</li><li>Li, Q., Maddox, C., Rasmussen, L., Hobrath, J. V., White, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+development+and+high+throughput+antiviral+drug+screening+against+Bluetongue+virus.">Assay development and high throughput antiviral drug screening against Bluetongue virus.</a> Antiviral Research. 83, 267-273 (2009).</li><li>Noah, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+luminescence+assay+is+effective+for+high-throughput+screening+of+potential+influenza+antivirals.">A cell-based luminescence assay is effective for high-throughput screening of potential influenza antivirals.</a> Antiviral Res. 73, 50-59 (2007).</li><li>Che, P., Wang, L., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development,+optimization+and+validation+of+an+assay+for+high+throughput+antiviral+drug+screening+against+Dengue+virus.">The development, optimization and validation of an assay for high throughput antiviral drug screening against Dengue virus.</a> Int. J. Clin. Exp. Med. 2, 363-373 (2009).</li><li>Li, Q., Li, H., Blitvich, B. J., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aedes+albopictus+inhibitor+of+apoptosis+1+gene+protects+vertebrate+cells+from+bluetongue+virus-induced+apoptosis.">The Aedes albopictus inhibitor of apoptosis 1 gene protects vertebrate cells from bluetongue virus-induced apoptosis.</a> Insect Mol. Biol. 16, 93-105 (2007).</li><li>Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+MTT+and+ATP-based+assays+for+the+measurement+of+viable+cell+number.">Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell number.</a> J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).</li><li>Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+bovine+respiratory+syncytial+virus+(BRSV)+from+cDNA:+BRSV+NS2+is+not+essential+for+virus+replication+in+tissue+culture,+and+the+human+RSV+leader+region+acts+as+a+functional+BRSV+genome+promoter.">Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter.</a> J. Virol. 73, 251-259 (1999).</li><li>Phillips, T., Jenkinson, L., McCrae, C., Thong, B., Unitt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+high-throughput+human+rhinovirus+infectivity+cell-based+assay+for+identifying+antiviral+compounds.">Development of a high-throughput human rhinovirus infectivity cell-based assay for identifying antiviral compounds.</a> J. Virol. Methods. 173, 182-188 (2011).</li><li>Harvey, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetracycline-inducible+packaging+cell+line+for+production+of+flavivirus+replicon+particles.">Tetracycline-inducible packaging cell line for production of flavivirus replicon particles.</a> J. Virol. 78, 531-538 (2004).</li><li>Puig-Basagoiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+assays+using+a+luciferase-expressing+replicon,+virus-like+particles,+and+full-length+virus+for+West+Nile+virus+drug+discovery.">High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 4980-4988 (2005).</li><li>Puig-Basagoiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triaryl+pyrazoline+compound+inhibits+flavivirus+RNA+replication.">Triaryl pyrazoline compound inhibits flavivirus RNA replication.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 50, 1320-1329 (2006).</li><li>Duan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+protection+against+the+highly+pathogenic+H5N1+influenza+virus+by+an+antisense+phosphorothioate+oligonucleotide.">In vitro and in vivo protection against the highly pathogenic H5N1 influenza virus by an antisense phosphorothioate oligonucleotide.</a> Antivir. Ther. 13, 109-114 (2008).</li><li>Ray, D., Shi, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+flavivirus+antiviral+drug+discovery+and+vaccine+development.">Recent advances in flavivirus antiviral drug discovery and vaccine development.</a> Recent Pat. Antiinfect. Drug Discov. 1, 45-55 (2006).</li><li>Severson, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+a+100,000-compound+library+for+inhibitors+of+influenza+A+virus+(H3N2).">High-throughput screening of a 100,000-compound library for inhibitors of influenza A virus (H3N2).</a> J. Biomol. Screen. 13, 879-887 (2008).</li><li>Severson, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+high-throughput+screen+for+inhibitors+of+SARS+CoV+and+its+application+in+screening+of+a+100,000-compound+library.">Development and validation of a high-throughput screen for inhibitors of SARS CoV and its application in screening of a 100,000-compound library.</a> J. Biomol. Screen. 12, 33-40 (2007).</li><li>Bolken, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+potent+small+molecule+inhibitor+of+hemorrhagic+fever+New+World+arenaviruses.">Identification and characterization of potent small molecule inhibitor of hemorrhagic fever New World arenaviruses.</a> Antivir. Res. 69, 86-97 (2006).</li><li>Van Loock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-throughput+cellular+screening+assay+for+the+discovery+of+HIV-1+integrase+inhibitors.">A novel high-throughput cellular screening assay for the discovery of HIV-1 integrase inhibitors.</a> J. Virol. Methods. 179, 396-401 (2012).</li><li>Kampmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+screening+of+small+molecule+libraries+using+the+dengue+virus+envelope+E+protein+has+identified+compounds+with+antiviral+activity+against+multiple+flaviviruses.">In silico screening of small molecule libraries using the dengue virus envelope E protein has identified compounds with antiviral activity against multiple flaviviruses.</a> Antiviral Res. 84, 234-241 (2009).</li><li>Kirchmair, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+anti-viral+agents+using+molecular+modeling+and+virtual+screening+techniques.">Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques.</a> Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).</li></ol>

Para a identificação inicial de visitas antivirais, um dos passos chave para a descoberta da droga anti-viral e de desenvolvimento consiste em desenvolver ensaios robustos, que inclui a selecção de um marcador quantificável, o desenvolvimento de um protocolo simples, obter sinais suficientes e menos do que 10% CV. A maioria das telas bioquímicos ou à base de células são projetados para fornecer um ponto de partida química baseada na mais robusta, ensaio simples e barato, devido à reprodutibilidade requerida n...

BTV é um protótipo de cadeia dupla de RNA vírus do gênero Orbivirus, família Reoviridae. BTV é uma das doenças mais importantes da pecuária nacional, incluindo ovelhas, cabras, gado e outros animais domésticos, com a perda de 3.000 milhões dólares americanos / ano em todo o mundo 1,2. O exótico sorotipo BTV é um importante patógeno animal enumerados nas &quot;USDA alta Consequence Pecuária Patógenos&quot;. Recentemente, o re-emergente de BTV causou um grande surto da doença em bovinos e ovinos em vários países em todo o norte da Europa 3,4. Como resultado do seu significado económico e como um sistema modelo, BTV tem sido o objecto de estudos moleculares, genéticos e estruturais extensas, e várias vacinas têm sido desenvolvidos. No entanto, devido à falta de ensaios adequados para a descoberta da droga anti-viral, não existem medicamentos antivirais disponíveis contra BTV. Em recente pesquisa de alto rendimento campanha (HTS), utilizando o sistema BTV como modelo, nós developed, otimizado e validado um ensaio baseado em CPE para identificar potenciais antivirais de amplo espectro contra arbovírus 5. Ensaio baseado CPE é um ensaio bem conhecido que tem sido utilizado na descoberta de drogas anti-viral contra um número de vírus que induzida rápida e observável CPE / apoptose 5-7. No nosso sistema, infecção pós BTV, CPE é evidente em células de vertebrados, incluindo HeLa, BSR, e HEK 293T 8. CPE induzida por vírus da febre catarral pode ser monitorizada e quantificado usando vários métodos de detecção de viabilidade celular, incluindo o kit de reagente de viabilidade celular CellTiter Glo (kit CTG) 9. Este kit determina o número de células viáveis ​​em cultura com base na quantificação de ATP celular apresentado, o que sinaliza a presença de células vivas, metabolicamente activas. Sob condições otimizadas, o ensaio baseado em CPE aqui apresentado mostrou sua viabilidade com o protocolo de um passo &quot;misturar e medir&quot;, e flexibilidade com sinais luminescentes estáveis. Enquanto isso, os compostos tóxicos reducing viabilidade celular irá ser excluída no presente ensaio baseia-CPE. O ensaio baseado CPE mostrou a sua robustez e fiabilidade para a descoberta da droga anti-viral contra o vírus da febre catarral, e tem sido utilizada para rastrear o NIH Molecular Bibliotecas de Moléculas Pequenas Repository (MLSMR), que conduz à identificação de seis novos aglomerado de potencial composto principal antiviral (s ) 5. Quando um composto antiviral potencial foi identificado usando o ensaio baseado em CPE, que terá de ser submetida ao ensaio de dose-resposta de dez concentração para determinar o intervalo de eficácia antiviral e citotoxicidade 2. A eficácia antiviral, representada como a concentração inibidora 50% (IC50) ou a concentração eficaz 50% (CE 50), é a concentração de uma droga que inibe a CPE induzida por vírus a meio caminho entre a linha de base e no máximo. A citotoxicidade dos antivirais, ou seja, a concentração de 50% de citotoxicidade (CC 50), é a concentraçãode um fármaco induzir 50% de citotoxicidade entre a linha de base e no máximo. O índice selectivo (SI), denotada como 50% de Si (SI 50) é calculado a partir de CC50 / IC 50, que determina a especificidade do anti-viral contra a CPE induzida por vírus. A IC50 (ou EC50), CC 50 e SI 50 valores são medidas importantes para determinar se um composto antiviral é potente e selectivo para o desenvolvimento de drogas. Quando um antiviral mostrou nenhuma toxicidade manifesta in vitro, no entanto, impedido de vírus induzido CPE e o ciclo de vida viral produtiva, é importante caracterizar a sua MOA 2. Iniciamos tal caracterização através da realização de ensaio ToA para determinar a possível etapa (s) do ciclo de vida viral que é afetada pelo antiviral. Geralmente, composto antiviral foram adicionados às células em diferentes épocas pré-ou pós-infecção de vírus. Se os antivirais foram adicionados às células infectadas pôr ao seu alvo step durante o curso da infecção, ela iria resultar em menor actividade, quando comparada com a que foi adicionada antes do passo. Assim, o estudo ToA é crítico para a determinação da eficácia anti-viral de um composto, e o seu alvo potencial, quer no ciclo de vida viral ou a máquina hospedeira envolvidas no ciclo de vida viral. Para todos os três ensaios, a viabilidade celular foi determinada utilizando o kit CTG seguindo as instruções do fabricante 5. Este sistema de detecção emite sinais de luminescência adequadas que poderiam ser analisadas por diversos softwares em casa. Cada ensaio foi validado e executada, pelo menos, em triplicado, com oito réplicas. Para todos os dados obtidos, três parâmetros, incluindo o valor médio (AVE), o desvio padrão (STDEV), e variação de co-eficiente (CV) foram analisados ​​para determinar a robustez do ensaio. Uma vez que a robustez do ensaio foi determinado, os dados irão ser ainda analisada e representada usando vários biostatics e graficaferramentas c 2.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1134218</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1000185</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gbico</td>
			<td>1049769</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo (CTG) kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>TB288</td>
			<td>For cell viability measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S25309B</td>
			<td>Diluted from 95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antiviral huashilcompounds</td>
			<td>NIH MLSMR and de novo synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTV-10</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSR cell</td>
			<td>Developed in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy-II multi-mode microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>For luminescent signal reading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroFlo select dispenser</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>Adding cells, virus, and reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well flat-bottom microplate</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>28908031</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen. 5 software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 5</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Version 5</td>
			<td>For biostatic analysis and plot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for the identification of novel antivirals against bluetongue virus

Para identificar potenciais antivirais contra BTV, temos desenvolvido, otimizado e validado três ensaios aqui apresentados. O ensaio baseado CPE foi o primeiro ensaio foi desenvolvido para avaliar se um composto mostrou qualquer eficácia antiviral e foram utilizados para rastrear o composto biblioteca grande. Enquanto isso, a citotoxicidade dos antivirais podem também ser avaliadas utilizando o ensaio baseado em CPE. O ensaio dose-resposta foi concebido para determinar a gama de eficácia para o antiviral seleccionado, isto é, 50% da concentração inibitória (IC50), ou a concentração eficaz (EC 50), bem como a sua gama de citotoxicidade (CC 50). O ensaio ToA foi utilizado para o estudo inicial Moa para determinar o mecanismo subjacente dos novos antivirais durante BTV ciclo de vida viral ou o possível efeito sobre acolhimento maquinaria celular. Estes ensaios são essenciais para a avaliação da eficácia antiviral no sistema de cultura de células, e têm sido usados ​​para nossas pesquisas recentes levamção para a identificação de uma série de novos medicamentos antivirais contra BTV.

1. Eficácia antiviral de composto O ensaio de ECP de base celular foi desenvolvido, optimizado e validado in vitro utilizando o kit à base de CTG luminescente para identificar novos medicamentos antivirais contra BTV como descrito anteriormente de 2,5. O ensaio de resposta de dez dose foi empregada para reflectir a eficácia antiviral e citotoxicidade de um composto de chumbo identificados medindo o número de células metabolicamente viáveis ​​em cultura com base na ...

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Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Três ensaios, incluindo o efeito citopático (CPE) baseado em ensaio, o ensaio de dose-resposta e (TOA) ensaio de Tempo-de-adição ter sido desenvolvido, optimizado e validado e utilizado para identificar novos medicamentos antivirais contra o vírus da febre catarral (VFC), bem como para determinar o possível mecanismo de ação-de-(MOA) para antivirais recentemente identificados.

Ensaios para a identificação de novos antivirais contra a febre catarral ovina vírus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Research

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