Name: in vitro assay to evaluate the impact of immunoregulatory pathways on hiv-specific cd4 t cell effector function
Uploaded: 2013-10-15T17:45:00
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Ringraziamo Gordon Freeman per fornire l&#39;anticorpo blocco anti-PD-L1. Ringraziamo il personale clinico e di laboratorio presso il Massachusetts General Hospital e tutti i partecipanti di studio per il loro prezioso ruolo in questo progetto. Questo studio è stato sostenuto dal National Institute of Allergy e Malattie Infettive dei National Institutes of Health (PO1 AI-080192; DEK), il National Heart Lung and Blood Institute dei National Institutes of Health (RO1 HL-092565; DEK). DEK è supportato da un Research Scholar Premio alla Carriera della Salute Research Fund Quebec (FRQS). FP è supportata da una sovvenzione borsa di studio del General Hospital Comitato Esecutivo del Massachusetts per la ricerca e la Harvard Global Institute Salute (HGHI).

1. Impoverimento e isolamento delle PBMC mediante Ficoll Separazione <ol><li> Deplezione delle cellule T CD8 +, aggiungendo umano CD8 + Depletion Cocktail a 50 microlitri / ml di sangue intero. </li><li> Mescolare bene e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente (18-25 ° C). </li><li> Dopo l&#39;incubazione, mescolare sangue intero con HBSS (soluzione salina bilanciata di Hank senza Ca 2 + o Mg 2 +) e strato sopra Histopaque. Spin a 340 rcf per 30 minuti (senza freni, accelerazione lenta). <...

<ol>
	<li>Zajac, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+immune+evasion+due+to+persistence+of+activated+T+cells+without+effector+function.">Viral immune evasion due to persistence of activated T cells without effector function.</a> J. Exp. Med. 188, 2205-2213 (1998).</li><li>Wherry, E. J., Blattman, J. N., Murali-Krishna, K., vander Most, R., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+persistence+alters+CD8+T-cell+immunodominance+and+tissue+distribution+and+results+in+distinct+stages+of+functional+impairment.">Viral persistence alters CD8 T-cell immunodominance and tissue distribution and results in distinct stages of functional impairment.</a> J. Virol. 77, 4911-4927 (2003).</li><li>Kwon, D. S., Kaufmann, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+detrimental+roles+of+IL-10+in+HIV+pathogenesis.">Protective and detrimental roles of IL-10 in HIV pathogenesis.</a> Eur. Cytokine Netw. 21, 208-214 (2010).</li><li>Porichis, F., Kaufmann, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+PD-1+in+HIV+pathogenesis+and+as+target+for+therapy.">Role of PD-1 in HIV pathogenesis and as target for therapy.</a> Curr. HIV/AIDS Rep. 9, 81-90 (2012).</li><li>Wherry, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+exhaustion.">T cell exhaustion.</a> Nat. 12, 492-499 (2011).</li><li>Trautmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+PD-1+expression+on+HIV-specific+CD8++T+cells+leads+to+reversible+immune+dysfunction.">Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction.</a> Nat. Med. 12, 1198-1202 (2006).</li><li>Day, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+expression+on+HIV-specific+T+cells+is+associated+with+T-cell+exhaustion+and+disease+progression.">PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression.</a> Nature. 443, 350-354 (2006).</li><li>Brockman, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-10+is+up-regulated+in+multiple+cell+types+during+viremic+HIV+infection+and+reversibly+inhibits+virus-specific+T+cells.">IL-10 is up-regulated in multiple cell types during viremic HIV infection and reversibly inhibits virus-specific T cells.</a> Blood. 114, 346-356 (2009).</li><li>Barber, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoring+function+in+exhausted+CD8+T+cells+during+chronic+viral+infection.">Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection.</a> Nature. 439, 682-687 (2006).</li><li>Zhang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+up-regulation+is+correlated+with+HIV-specific+memory+CD8++T-cell+exhaustion+in+typical+progressors+but+not+in+long-term+nonprogressors.">PD-1 up-regulation is correlated with HIV-specific memory CD8+ T-cell exhaustion in typical progressors but not in long-term nonprogressors.</a> Blood. 109, 4671-4678 (2007).</li><li>Ndhlovu, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-dimensional+immunomonitoring+models+of+HIV-1-specific+CD8+T-cell+responses+accurately+identify+subjects+achieving+spontaneous+viral+control.">High-dimensional immunomonitoring models of HIV-1-specific CD8 T-cell responses accurately identify subjects achieving spontaneous viral control.</a> Blood. 121, 801-811 (2013).</li><li>Porichis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responsiveness+of+HIV-specific+CD4+T+cells+to+PD-1+blockade.">Responsiveness of HIV-specific CD4 T cells to PD-1 blockade.</a> Blood. 118, 965-974 (2011).</li><li>Kwon, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++CD25++regulatory+T+cells+impair+HIV-1-specific+CD4+T+cell+responses+by+upregulating+interleukin-10+production+in+monocytes.">CD4+ CD25+ regulatory T cells impair HIV-1-specific CD4 T cell responses by upregulating interleukin-10 production in monocytes.</a> 86, 6586-6594 (2012).</li></ol>

Collezione surnatante è una parte fondamentale di questo progetto sperimentale. Durante la raccolta surnatanti per il dosaggio Luminex, sono state fatte aliquote e conservati a -80 ° C per evitare la degradazione della proteina causa gelo-disgelo. Congelamento e scongelamento può essere processi dure per le proteine, e riducendo al minimo freeze-disgelo, il segnale sarà massimizzata in saggi. Pertanto, è più facile ottenere dati ripetibile e preciso quando si lavora da aliquote che sono stati scongelati freeze-lo ...

Durante le infezioni virali persistenti, specifiche cellule-T virus acquisiscono difetti funzionali in un processo noto come l&#39;esaurimento delle cellule T. All&#39;inizio studi in vivo nel modello murino LCMV di infezione virale cronica indicato che le cellule T virus-specifici esauste una riduzione della funzione citolitica contro cellule infettate da virus, perdono la loro capacità di proliferare e una capacità ridotta di produrre citochine come IL-2, TNF- α e IFN-γ 1,2. Complessa rete di percorsi immunomodulanti, come PD-1 e IL-10, sono upregulated durante le infezioni croniche e contribuire alla disfunzione delle cellule T (recensito in 3,4). Nella somministrazione in vivo di bloccare anticorpi contro queste vie inibitorie nel topo LCMV modello di funzione delle cellule T virus-specifici esaurite e la clearance virale maggiore restaurato, indicando che l&#39;esaurimento delle cellule T è un fenomeno parzialmente reversibile (recensito in 5). Giudizio su °e modello LCMV sono stati rapidamente estesa a infezioni virali croniche umani quali HBV, HCV e HIV 5. In cronica da HIV-1, PD-1 e IL-10 percorsi sono upregulated in soggetti infetti e correlano con parametri di progressione della malattia, direttamente con la carica virale e inversamente con la conta CD4 6-8. Anticorpo blocco dei PD-1 o IL-10 percorsi in vitro restaurato proliferazione di HIV-specifiche cellule T CD4 e CD8 indicano che, simile al modello di topo LCMV, esaurimento delle cellule T nell&#39;uomo è un fenomeno parzialmente reversibile. Tuttavia, a causa della natura delicata di esperimenti su campioni umani nonché limitazioni nella sensibilità dei saggi in vitro, un&#39;indagine approfondita dei profili ripristino funzionale ottenuti da questi interventi è sorprendentemente assente. Saggi di proliferazione sono stati, finora, l&#39;unico test affidabile in vitro testato in maggior parte degli studi, ma vi è una notevole mancanza di prove sull&#39;impatto di questi, tra l&#39;interventi su: 1) la capacità di uccisione delle cellule T citotossiche, 2) l&#39;effetto antivirale di cellule T sulla replicazione virale, 3) il profilo secrezione di citochine, e 4) l&#39;effetto su aiuto delle cellule T CD4 su altri sottogruppi di cellule. Intracellulare di citochine colorazione (ICS) è un flusso molto utile e ampiamente utilizzati saggio basato citometria che viene utilizzato per rilevare la produzione di citochine in vari tipi di cellule, sia nei topi e nell&#39;uomo. E &#39;stato anche utilizzato per studiare l&#39;effetto di anticorpi blocco di vie inibitorie. In saggi ICS, secrezione di citochine è bloccata con l&#39;aggiunta di brefeldina e / o Monensina. Le citochine intrappolati all&#39;interno delle cellule sono poi rilevate con anticorpi fluorescenti con citometria a flusso policromo. La durata del test è solitamente limitato a 6 o 12 ore dopo la stimolazione antigene poiché sia ​​brefeldina e monensina, che sono tipicamente aggiunti in 2 ore di antigene indicato, sono tossici per le cellule. Il saggio ICS è una potente tecnica che è stata i utilen l&#39;indagine l&#39;effetto della somministrazione in vivo di bloccare intervento anticorpo nei topi in cui le cellule sono state estratte dopo un certo periodo di tempo dopo l&#39;esposizione anticorpo 9. Tuttavia, vi sono diverse limitazioni per l&#39;applicazione di questo approccio sperimentale per valutare l&#39;impatto del blocco dei recettori inibitori in campioni umani. Durante l&#39;esecuzione di interventi di anticorpi vie inibitorie in un hr stimolazione 6 o 12 in vitro (tipicamente il caso con campioni umani), il blocco dei recettori inibitori in molti casi non modifica la frequenza di rispondere cellule T antigene-specifiche come misurata mediante saggi circuiti integrati standard 6, 7. Le misurazioni della produzione di citochine per cella misurati mediante media o la mediana intensità di fluorescenza hanno dato risultati inconsistenti 6, 7, 10. D&#39;altra parte, quando ICS viene eseguita in un punto temporale in ritardo dopo la stimolazione (ovvero sei giorni), le variazioni del numero di citochina-secernente cells possono essere osservati. Le differenze sono un effetto combinato della proliferazione alterata, sopravvivenza, e cambiamenti nella funzione effettrice che si accumulano durante il periodo di tempo specificato 6. Un modo per superare in parte questi limiti è quello di incubare per lunghi periodi di tempo (ad esempio 36 hr, 60 hr, ecc.) Con l&#39;antigene prima l&#39;aggiunta del bloccante secrezione di citochine senza attendere la proliferazione si verifichi. Abbiamo utilizzato con successo questo metodo per determinare la cinetica di secrezione di citochine da HIV-specifiche cellule T CD4 e CD8 11,12, tuttavia, questo approccio non è in grado di rilevare piccole risposte e non dia un risultato integrata della secrezione di citochine totale verificano poiché la stimolazione. Pertanto, ICS non è un metodo abbastanza sensibile per rilevare l&#39;impatto del blocco di vie inibitorie sulla quantità di citochine prodotte dalle cellule T attivate rispetto a mRNA quantitativa o misure di secrezione di citochine nel supernatant agli stessi punti temporali. Inoltre, la maggior parte delle citochine prodotte dalle cellule T attivate agire in maniera autocrina contribuendo al feedback positivo o negativo passanti attraverso l&#39;interazione con le cellule presentanti l&#39;antigene. Pertanto, l&#39;aggiunta di brefeldina o Monensina durante il saggio ICS impedisce la secrezione di citochine e quindi la stimolazione delle cellule T non è ottimale. Infine, il rilevamento di citochine multiple con ICS è limitata dalla disponibilità e sensibilità di anticorpi per il rilevamento di citochine mediante citometria a flusso, nonché da vincoli nel numero di fluorocromi che possono essere utilizzati contemporaneamente in un dato pannello. Abbiamo sviluppato un approccio altamente sensibile in vitro sperimentale per valutare l&#39;impatto delle vie immunomodulanti nella regolazione della secrezione di citochine da HIV-specifiche cellule T CD4 e successivamente CD4 contribuiscono a cellule presentanti l&#39;antigene (APC) e le cellule natural killer (cellule NK). Questo metodo può anche essere utilizzato per valutare l&#39;impact del blocco di molecole inibitori sulla funzione delle cellule T CD8 mediante deplezione delle cellule T CD4 da PBMC o stimolando con peptidi ottimali che vengono riconosciuti solo dalle cellule T CD8. In contrasto intracellulari saggi citochina colorazione, abbiamo deciso di non interferire con la secrezione di citochine da HIV-specifiche cellule T CD4 per essere in grado di: 1) effettuare una quantificazione più accurata dei livelli di citochine prodotte; 2) indagare un pannello più ampio di citochine o molecole effettrici e 3) valutare l&#39;impatto delle citochine prodotte da HIV-specifiche cellule T CD4 su altri sottoinsiemi di cellule. Stimoliamo CD8 PBMC impoverito a HIV-1 Gag piscina peptide in presenza di anticorpi bloccanti per la via immunoregolatorio di interesse. Dopo il tempo desiderato di incubazione, di solito 48 ore, raccogliamo il surnatante per misurare la secrezione di citochine con array di perline e raccogliere i pellet cellulari sia per l&#39;analisi fenotipica delle diverse sottopopolazioni cellulari o per l&#39;analisi trascrizionale. Da segnalare, al tempo til suo 48 punto di tempo hr, noi non rileva una significativa popolazione di cellule proliferanti T 12. Questo è un approccio flessibile e diversi adattamenti di questo motivo può essere applicato per affrontare diverse ipotesi. Per esempio, i singoli sottogruppi di cellule (come HIV-specifiche cellule T CD4 o PD-1 le cellule T CD4 elevati, ecc.) Possono essere scelti dopo 12 ore di incubazione prima ulteriore incubazione per 36 ore seguita da collezione di supernatanti e pellet cellulari indagare più specificamente l&#39;impatto degli interventi del blocco sulla secrezione di citochine da sottopopolazioni definite di PBMC.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution without Ca2+ or Mg2+</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9394</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R0883</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Histopaque-1077</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10771</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Human Serum AB</td>
			<td>Gemini BioProducts</td>
			<td>100-512</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>30 001 CI</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>25 005 CI</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>25060CI</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FcR blocking reagent, human</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-059-901</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>RosetteSep Human CD8+ Depletion Cocktail </td>
			<td>Stem Cell </td>
			<td>15663</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit, for UV excitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L23105</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Rneasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Improm-II Reverse Transcription System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3800</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master Mix</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>600830</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337100</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>IFN-&gamma; primer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>FOR: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GAPDH primer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>FOR: TCATCATCTCTGCCCCCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

in vitro assay to evaluate the impact of immunoregulatory pathways on hiv-specific cd4 t cell effector function

Esaurimento delle cellule T è un fattore importante nella riuscita di liquidazione patogeno durante le infezioni virali croniche. Percorsi immunomodulanti, come PD-1 e IL-10, sono upregulated su questa esposizione all&#39;antigene corso e contribuiscono alla perdita della proliferazione, riduzione della funzione citolitica e compromessa produzione di citochine da parte di cellule T CD4 e CD8. Nel modello murino di infezione LCMV, somministrazione di bloccare anticorpi contro queste due vie aumentata risposte delle cellule T. Tuttavia, attualmente non vi è prova in vitro per misurare l&#39;impatto di tale blocco sulla secrezione di citochine in cellule da campioni umani. Il nostro protocollo e approccio sperimentale ci consentono di quantificare con precisione e in modo efficiente il ripristino della produzione di citochine da HIV-specifiche cellule T CD4 da soggetti infetti da HIV. Qui, ci raffiguriamo un disegno sperimentale in vitro che consente misurazioni della secrezione di citochine da HIV-specifiche cellule T CD4 e il loro impatto su altri celsottoinsiemi l. Cellule T CD8 erano esaurite dal sangue intero e che restano PBMC sono state isolate tramite metodo di separazione Ficoll. PBMC CD8-impoverito sono state poi incubate con anticorpi bloccanti contro PD-L1 e / o IL-10Rα e, dopo stimolazione con HIV-1 piscina Gag peptide, le cellule sono state incubate a 37 ° C, 5% CO 2. Dopo 48 ore, il surnatante è stato raccolto per l&#39;analisi di citochine da perline array e pellet cellulari sono stati raccolti sia per l&#39;analisi fenotipica mediante citometria a flusso o l&#39;analisi trascrizionale mediante qRT-PCR. Per un&#39;analisi più dettagliata, diverse popolazioni cellulari sono stati ottenuti selettiva sottoinsieme esaurimento da PBMC o di classificare mediante citometria a flusso, prima di essere valutato negli stessi dosaggi. Questi metodi forniscono un approccio altamente sensibile e specifico per determinare la modulazione della produzione di citochine da parte di cellule T-helper antigene-specifiche e determinare interazioni funzionali tra diverse popolazioni di cellule immunitarie.

Per effettuare le misurazioni di citochine tramite questo sistema in vitro, è essenziale essere in grado di distinguere le risposte antigene-specifiche rispetto al controllo senza stimolazione. In generale, abbiamo preso in considerazione le risposte positive da tutti i valori della stimolazione antigenica che danno almeno tre volte aumento dei livelli di citochine rispetto al controllo nessuno stimolo e che erano all&#39;interno della gamma lineare del test. Stiamo usando ad alta sensibilità saggi di matrice...

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In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

Abbiamo sviluppato un test in vitro per studiare il ruolo delle vie immunomodulanti nella regolazione della secrezione di citochine da HIV-specifiche cellule T CD4.

In vitro per valutare l&#39;impatto di immunoregolatorio Pathways su HIV-specifica CD4 T effettrici delle cellule di funzione

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

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