Name: in vitro coculture assay to assess pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration
Uploaded: 2014-01-06T15:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration at JoVE.com

这项工作得到了NIH（1 R01 AI095338-01A1）的财政支持。

步骤 （1-3） 应在层压流罩下的无菌环境中执行。 
1. 胶原蛋白涂层透水井
<ol><li>制作 30μg/ml 胶原蛋白溶液。稀释 3 毫克/毫升胶原蛋白库存 1：100 在 60% 乙醇，已通过 0.2 μm 过滤器单元。</li>
	<li>漩涡稀释了 30μg/ml 溶液。注意：没有必要涡流3毫克/毫升胶原蛋白库存溶液，因为这个解决方案是相当粘稠的，气泡可能会引入，可能会降低管道时的准确性。</li>
	<li>从外部?...

中微霉素在粘膜上皮表面的迁移是感染细菌病原体后疾病病理学的一个常见特征。本文描述的方法提供了一种快速、直接的方法，利用人类细胞衍生的体外人工造影检测系统，对细菌感染引发的炎症过程的一个特征进行实验隔离。该系统最初是利用极化肠道上皮细胞开发的，该细胞感染了肠道病原体，包括沙门氏菌、西盖拉弹性内膜和各种致病性大肠杆菌8?...

粘胶表面作为物理和免疫屏障，为防止外部威胁在环境中普遍存在提供保护。当致病生物入侵2时，这种保护性上皮屏障可能会受到损害。在细菌病原体的情况下，这种相遇往往通过激活先天免疫系统和触发被称为嗜中性粒细胞2-4的第一反应器颗粒细胞的快速动员煽动炎症过程。促进中性粒细胞招募的化学诱因剂部分由粘膜上皮细胞产生，试图摆脱宿主的违规病原体2-4。粘膜上皮表面过度或未解决的中性粒细胞渗透可引起重大病理学1，5。这是抗菌中性粒细胞库5-7造成的非特异性组织损伤的结果。在这种情况下，中性粒细胞的细菌清除能力因传染性侮辱期间宿主组织的破坏而黯然失色。 保护性上皮屏障功能的破坏可导致基础组织对微生物和/或毒素的进一步暴露，进一步加剧疾病病理学8，9。这些后果可以在多个器官系统中观察到，包括肺和消化道1，5。此外，非感染性炎症条件，如严重的哮喘发作，慢性阻塞性肺病（COPD），急性呼吸窘迫综合征（ARDS）和炎症性肠病（IBD）的特点是，通过过度的嗜中性反应4，5，10-12的粘膜上皮屏障的病理突破。
粘体感染后中性粒细胞招募的复杂过程涉及几个分门别化步骤1，5，13，14。首先，嗜中性粒细胞必须通过一系列细胞对细胞的相互作用来脱离循环，促进跨内皮迁移1，13。中性粒细胞接下来导航现有的间歇空间，其中包含细胞外基质1，14。要到达受感染的粘膜的流明，中性粒细胞必须迁移穿过上皮屏障1，4，5。这种复杂的多步骤现象往往被综合使用体内动物模型感染15。这些模型有助于确定特定因素的必要性，如化疗因子、粘附分子或参与整个过程的信号通路，但在很大程度上不足以解决对每个不同分门别析步骤16至关重要的分子贡献。培养体外系统建模跨内皮，转矩阵，或中性粒细胞的跨上皮迁移在这方面特别有用1，14，16，17。
已发展出一套强大的共生检测系统，以破译负责中性粒细胞跨上皮迁移的机制，以应对18-22年的致病性感染。该模型涉及用细菌病原体感染极化人类上皮细胞层的 apical 表面，然后将新分离的人类中微子应用到基底层表面 18-22。中性粒细胞迁移跨越上皮屏障，以响应18，21-23年致病性感染后分泌的上皮衍生化学产品。该系统采用肠道和肺上皮培养物，暴露于适当的组织特定细菌病原体，并揭示了新的分子机制可能重要的中性粒细胞招募过程中，粘膜感染3，8，19，24-28。这种 体外 共生模式的优点是，一种还原方法使研究者能够在控制良好、可重现、相当便宜的系统中实验性地操纵病原体、上皮屏障和/或中性粒细胞。从这种方法中收集的见解可以有效地利用在中性粒细胞招募期间使用 体内 感染模型22，29，30进行分门别析事件的集中分析。
本文演示了成功建立这种可重复模型以探索病原体诱发的中微子跨上皮迁移所需的多个步骤。本文介绍了感染病原体 伪多莫纳斯动脉鲁吉诺萨的 肺上皮屏障：然而，其他组织表皮和病原体可以替代与轻微的修改。在倒置胶原蛋白涂层透气透水过滤器上对极化肺上皮细胞层的播种和培养进行了详细的介绍，致病性 P.aeruginosa 的生长和中微粒细胞从全血中分离也详细介绍了这一点。这些组件如何结合观察病原体诱发的中微子跨上皮迁移，并结合适当的正负对照组进行，以建立可重复的检测。本文结合文献中的具体研究，探讨了这种方法研究病原体诱导中性粒细胞跨上皮迁移各个方面的多功能性。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1470">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;">NCl-H292 cells</td>
			<td style="width:147px;">ATCC</td>
			<td style="width:137px;">CRL-1848</td>
			<td style="width:667px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;">RPMI-1640 medium</td>
			<td style="width:147px;">ATCC</td>
			<td style="width:137px;">30-2001</td>
			<td style="width:667px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;">Pseudomonas aeruginosa PAO1</td>
			<td style="width:147px;">ATCC</td>
			<td style="width:137px;">#47085</td>
			<td style="width:667px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;">Escherichia coli MC1000</td>
			<td style="width:147px;">ATCC</td>
			<td style="width:137px;">#39531</td>
			<td style="width:667px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;">D-PBS (1x) liquid</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">14190-144</td>
			<td style="width:667px;">without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;">Heat Inactivated Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">10082-147</td>
			<td style="width:667px;">10% added to culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">15140-122</td>
			<td style="width:667px;">100x: 10,000 units of penicillin and 10,000 &#181;g of streptomycin per ml.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;">Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">25300-062</td>
			<td style="width:667px;">50 ml aliquots are stored frozen at -20 &#186;C.&#160; Aliquot in use can be stored at 4 &#186;C short-term.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution - HBSS(-)</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">14175-079</td>
			<td style="width:667px;">Sterile, without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">15250-061.</td>
			<td style="width:667px;">Stock = 0.4%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;">Collagen, Rat Tail</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">A10483-01</td>
			<td style="width:667px;">Can also be isolated in the laboratory directly from the tails of rats using standard protocols</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;">Citric acid</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:137px;">C1909-500G</td>
			<td style="width:667px;">Component of 1 M citrate buffer and acid citrate dextrose (ACD) solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;">Sodium Citrate</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:137px;">S4641-500G</td>
			<td style="width:667px;">Component of 1 M citrate buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;">Dextrose anhydrous</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:137px;">D8066-250G</td>
			<td style="width:667px;">Component of acid citrate dextrose (ACD) solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;">Ammonium Chloride</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:137px;">213330-500G</td>
			<td style="width:667px;">Component of red blood cell (RBC) lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:137px;">S6014-500G</td>
			<td style="width:667px;">Component of red blood cell (RBC) lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;">EDTA</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:137px;">ED-100G</td>
			<td style="width:667px;">Component of red blood cell (RBC) lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;">HBSS(+) powder</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:137px;">H1387-10L</td>
			<td style="width:667px;">Key component of HBSS+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;">HEPES</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:137px;">H3375-500G</td>
			<td style="width:667px;">Component of HBSS+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;">Sigmacote</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:137px;">SL2-25ML</td>
			<td style="width:667px;">Follow vendor instructions to coat glass pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:137px;">T-9284</td>
			<td style="width:667px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;">2,2&#39;-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS)</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:137px;">A9941-50TAB</td>
			<td style="width:667px;">Key component of ABTS substrate solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;">30% Hydrogen Peroxide Solution</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:137px;">H1009-100ML</td>
			<td style="width:667px;">Component of ABTS substrate solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;">N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP or fMLF)</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:137px;">F-3506</td>
			<td style="width:667px;">A Stock solution of 10 mM in DMSO should be prepared and aliquots stored at -20 &#186;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;">Gelatin Type B</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">M-12026</td>
			<td style="width:667px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;">Pseudomonas isolation agar&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">DF0927-17-1</td>
			<td style="width:667px;">Follow manufacturer&#8217;s instructions to make PIA plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;">Ficoll-Paque PLUS&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">45-001-749</td>
			<td style="width:667px;">Optional, can improve neutrophil purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:667px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:667px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:667px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:667px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:667px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;">Name of Material / Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:137px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:667px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;">24-well migration plate</td>
			<td style="width:147px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:137px;">#3524</td>
			<td style="width:667px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;">24-well wash plate</td>
			<td style="width:147px;">Falcon</td>
			<td style="width:137px;">35-1147</td>
			<td style="width:667px;">Can be reused if soaked in 70% ethanol and washed thoroughly prior to reuse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;">96-well plate</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">#12565501</td>
			<td style="width:667px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:520px;">Transwell Permeable Supports&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:137px;">#3415</td>
			<td style="width:667px;">Polycarbonate; Diameter: 6.5 mm; Growth area: 0.33 cm2; Dish style: 24-well plate; Pore size: 3.0 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;">Petri dish</td>
			<td style="width:147px;">Falcon</td>
			<td style="width:137px;">35-1013</td>
			<td style="width:667px;">Each Petri dish holds 24 inverted 0.33 cm2 Transwells.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;">500 ml 0.2 &#956;m filter / flask</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">09-740-25A</td>
			<td style="width:667px;">To sterilize acid citrate dextrose (ACD) solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;">5-3/4 in glass Pasteur pipette</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">13-678-20A</td>
			<td style="width:667px;">Coat tips with Sigmacote prior to use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;">Hemostat</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">13-812-14</td>
			<td style="width:667px;">Curved, Serrated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;">Invertoskop Inverted Microscope</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:137px;">#342222</td>
			<td style="width:667px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:520px;">Versa-Max Microplate Reader</td>
			<td style="width:147px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:137px;">#432789</td>
			<td style="width:667px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro coculture assay to assess pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration

粘性表面是预防致病生物的防护屏障。当感应病原体导致组织与迁移的炎症细胞（主要是嗜中性粒细胞）的渗透时，先天免疫反应被激活。如果过度或处于未解决状态，此过程可能会对组织造成破坏性破坏。 可利用 体外 培养模型研究病原体诱导中性粒细胞跨上皮迁移中涉及的独特分子机制。这种类型的模型在实验设计中提供了多功能性，为控制病原体、上皮屏障或中性粒细胞提供了机会。在透水转井过滤器上生长的极性上皮单层的气质表面的致病感染，在生理上与玄武岩相关，对应用于玄武岩表面的嗜中性嗜血杆菌进行肛盖跨上皮迁移。此处描述的 体外 模型演示了在极化肺上皮单层中演示中性粒细胞迁移所需的多个步骤，该单层已感染致病性 P. aeruginosa （PAO1）。描述了用人类衍生的肺上皮细胞对透水转井进行播种和培养，同时从整个人类血液中分离中性粒细胞，并培养PAO1和非致病性K12 大肠杆菌 （MC1000）。 移民过程和对成功迁移的嗜中性粒细胞的定量分析，已动员起来应对致病性感染，并显示具有代表性的数据，包括正对照和负对照。这种 体外 模型系统可以操纵并应用于其他粘性表面。涉及中性粒细胞过度渗透的炎症反应可能对宿主组织具有破坏性，并且可能发生在没有致病性感染的情况下。通过实验操纵本文所述的 体外 共生检测系统，更好地了解促进中性粒细胞跨上皮迁移的分子机制，对于确定一系列粘膜传染病和炎症性疾病的新治疗目标具有重大潜力。

多项研究表明，病原体感染的上皮层促进中微子跨上皮迁移3，8，19，24-28，31，32。这发生在一个上皮细胞衍生的中性粒细胞化学梯度3，23的病原体特异性诱导。例如，致病 性P.aeruginosa 与肺上皮细胞的顶层相互作用，导致大量嗜中性粒细胞在上皮层18，22，25，26，33，34迁移。这种临床相关的检测系统可以以多种方式进行操作，在与适当的控制配对时，揭开关键病原?...

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In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

体外 共生分析评估病原体诱导中性粒细胞跨上皮迁移

中性粒细胞跨上皮迁移，以应对粘膜细菌感染，有助于上皮损伤和临床疾病。已经开发出一种 体外 模型，结合了病原体、人类嗜中性粒细胞和在转井过滤器上生长的极化人类上皮细胞层，以促进研究，以解开协调这一现象的分子机制。

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Assay for Pathogen-Associated Molecular Pattern (PAMP)-Triggered Immunity (PTI) in Plants

Assay for Pathogen-Associated Molecular Pattern PAMP-Triggered Immunity PTI in Plants

含量为病原体相关分子模式（PAMP）触发免疫功能的植物（公共交通交汇处）

To perceive potential pathogens in their environment, plants use pattern recognition receptors (PRRs) present on their plasma membranes. PRRs recognize ...

科研

免疫与感染

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

追踪中性粒细胞腔内的爬行，活体视频显微镜Transendothelial组织中的迁移和趋化

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

量<em在体外</em&gt;激活的主人微血管内皮细胞在静态条件下测量的检测，以中性粒细胞粘附

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

人中性粒细胞迁移的跨越培养膀胱上皮定量评价

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

人中性粒细胞流动室粘附实验

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

中性粒细胞分离和分析，以确定他们的淋巴瘤细胞的敏感性对治疗药物的作用

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

一种新的体外创面愈合试验评价细胞迁移

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

小鼠边缘区 b 细胞剪切流诱导迁移的体外分析

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

一种评估和定量中性粒细胞外细胞陷阱形成的高通量检测

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评估细菌病原体免疫反应的声吞噬杀灭试验

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

体外 共生分析评估病原体诱导中性粒细胞跨上皮迁移

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