Name: stress-induced antibiotic susceptibility testing on a chip
Uploaded: 2014-01-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip at JoVE.com

We danken de ingenieurs en studenten van het Fraunhofer Center for Manufacturing Innovation. Voor het helpen bij het ontwerp, de bewerking en de automatisering van het experimentele systeem, bedanken we Andreas Prinzen, Holger Wirz, Doug Foss, David Chargin en Dr. Sudong Shu. We danken Julia Kuckartz, Melanie Zimmermann, Niko Kraetzmar, Tim Gumbel, Josh Villanueva, Minori Shimizu en Katarzyna Kuliga voor hulp bij het testen van experimentele protocollen en het verzamelen van gegevens. We erkennen Drs. Anne E. Carpenter en Mark-Anthony Bray van het Imaging Platform van het Broad Institute of Harvard en MIT voor hulp bij de ontwikkeling van de beeldanalyseroutine in CellProfiler. Het beschreven project werd gedeeltelijk ondersteund door awards R21AI079474 en 1R01AI101446 van het National Institute of Allergy and Infectious Diseases. De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële opvattingen van het National Institute of Allergy and Infectious Diseases of de National Institutes of Health. Het project werd ook ondersteund door Fraunhofer USA.

1. Maak de PDMS-laag (figuur 1)
<ol><li>Meng PDMS en curing agent krachtig in een 10:1 verhouding. Om bellen te verwijderen, ontgast u het viskeuze mengsel gedurende 1 uur in een vacuümkamer bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Giet het PDMS op een schaal langzaam over de aluminium mal. Giet vanuit het midden en houd de mal waterpas. Zorg ervoor dat u de pinnen onbedekt laat. Stop met gieten zodra het streefgewicht is bereikt. Onze mal vereist 4 g PDMS en 0,4 g uithardend reagens.
</li>
	<li>Breng de mal waterp...

<ol>
	<li>Mairhofer, J., Roppert, K., Ertl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+systems+for+pathogen+sensing:+a+review.">Microfluidic systems for pathogen sensing: a review.</a> Sensors. 9, 4804-4823 (2009).</li><li>Yager, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+diagnostic+technologies+for+global+public+health.">Microfluidic diagnostic technologies for global public health.</a> Nature. 442, 412-418 (2006).</li><li>Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+bacteria+and+determining+their+susceptibility+to+antibiotics+by+stochastic+confinement+in+nanoliter+droplets+using+plug-based+microfluidics.">Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics.</a> Lab Chip. 8, 1265-1272 (2008).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+toxicological+complexity+by+multi-dimensional+screenings+in+microsegmented+flow:+modulation+of+antibiotic+interference+by+nanoparticles.">Uncovering toxicological complexity by multi-dimensional screenings in microsegmented flow: modulation of antibiotic interference by nanoparticles.</a> Lab Chip. 12, 474-484 (2012).</li><li>Chen, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+susceptibility+testing+using+high+surface-to-volume+ratio+microchannels.">Antimicrobial susceptibility testing using high surface-to-volume ratio microchannels.</a> Anal. Chem. 82, 1012-1019 (2010).</li><li>Churski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+screening+of+antibiotic+toxicity+in+an+automated+microdroplet+system.">Rapid screening of antibiotic toxicity in an automated microdroplet system.</a> Lab Chip. 12, 1629-1637 (2012).</li><li>Eun, Y. J., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulating+bacteria+in+agarose+microparticles+using+microfluidics+for+high-throughput+cell+analysis+and+isolation.">Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation.</a> ACS Chem. Biol. 6, 260-266 (2011).</li><li>Kim, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+monitoring+of+antibiotic+susceptibility+of+bacterial+biofilms+in+a+microfluidic+device.">In situ monitoring of antibiotic susceptibility of bacterial biofilms in a microfluidic device.</a> Lab Chip. 10, 3296-3299 (2010).</li><li>Peitz, I., van Leeuwen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+bacteria+growth+monitoring+by+automated+DEP-facilitated+image+analysis.">Single-cell bacteria growth monitoring by automated DEP-facilitated image analysis.</a> Lab Chip. 10, 2944-2951 (2010).</li><li>Kalashnikov, M., Lee, J. C., Campbell, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+rapid,+stress-induced+antibiotic+susceptibility+testing+of+Staphylococcus+aureus.">A microfluidic platform for rapid, stress-induced antibiotic susceptibility testing of Staphylococcus aureus.</a> Lab Chip. 12, 4523-4532 (2012).</li><li>McDonald, J. C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(dimethylsiloxane)+as+a+material+for+fabricating+microfluidic+devices.">Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices.</a> Acc. Chem. Res. 35, 491-499 (2002).</li><li>Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+viability+and+antibiotic+susceptibility+testing+with+SYTOX+green+nucleic+acid+stain.">Bacterial viability and antibiotic susceptibility testing with SYTOX green nucleic acid stain.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 2421-2431 (1997).</li><li>Francius, G., Domenech, O., Mingeot-Leclercq, M. P., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+Staphylococcus+aureus+cell+wall+digestion+by+lysostaphin.">Direct observation of Staphylococcus aureus cell wall digestion by lysostaphin.</a> J. Bacteriol. 190, 7904-7909 (2008).</li><li>Jordan, S., Hutchings, M. I., Mascher, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+envelope+stress+response+in+Gram-positive+bacteria.">Cell envelope stress response in Gram-positive bacteria.</a> FEMS Microbiol. Rev. 32, 107-146 (2008).</li><li>Koch, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+wall+as+target+for+attack:+past,+present,+and+future+research.">Bacterial wall as target for attack: past, present, and future research.</a> Clin. Microbiol. Rev. 16, 673-687 (2003).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100 (2006).</li><li>Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+antibiotics+kill+bacteria:+from+targets+to+networks.">How antibiotics kill bacteria: from targets to networks.</a> Nat. Rev. Microbiol. 8, 423-435 (2010).</li><li>Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Hayete, B., Lawrence, C. A., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+mechanism+of+cellular+death+induced+by+bactericidal+antibiotics.">A common mechanism of cellular death induced by bactericidal antibiotics.</a> Cell. 130, 797-810 (2007).</li></ol>

Het gepresenteerde protocol werd gevalideerd en geoptimaliseerd in een reeks experimenten met methicillinegevoelige en methicillineresistente Staphylococcus aureus stammen10. Daarom moet dit protocol zonder wijziging rechtstreeks van toepassing zijn op andere stammen van S. aureus en andere antibiotica met werkingsmechanismen die de biosynthese van de bacteriële celwand beïnvloeden. Andere bacterietypen dan S. aureus kunnen variatie in de stressparameters vereisen: oplosbare (enzym...

De opkomst van bacteriële resistentie versterkt de behoefte aan snelle op fenotype gebaseerde antibioticagevoeligheidstests om onze geneesmiddelen in laatste instantie te beschermen. Standaard gevoeligheidstests zijn gebaseerd op bacteriële groeiremming in aanwezigheid van antibiotica die meerdere (8-24) uur in beslag nemen. We hebben een nieuwe antibioticagevoeligheidstest ontwikkeld op een microfluïdisch platform dat afhankelijk is van de stressactivering van biosyntheseroutes om de werking van antibiotica te versnellen.
Antibiotica gevoeligheidstests op microfluïdische schaal hebben het voordeel van effectief monstergebruik, omdat ze kleine aantallen bacteriën vereisen. Bovendien kunnen microfluïdische apparaten worden gemulderd om meerdere monsters onder meerdere omstandigheden te testen1,2. Onlangs zijn een aantal microfluïdische methoden voor antibioticagevoeligheidstests gemeld3-9. In deze methoden worden bacteriën gekweekt in nano- en picoliterdruppels3,7, in het volledige volume van het microfluïdische kanaal4-6,8, of als enkele bacteriën elektrisch gelokaliseerd op het onderste oppervlak van kanaal9. Hoewel deze tests worden uitgevoerd in microfluïdische kanalen, monitoren ze allemaal de microbiële groei in de aan- en afwezigheid van antibiotica die vergelijkbaar zijn met traditionele methoden. Groeimetingen worden uitgevoerd via optische dichtheid, pH-gevoelige kleurstoffen of heldere veld-/fasecontrast- of fluorescentiebeelden. Hoewel sommige van deze tests sneller zijn dan traditionele methoden, detecteren ze elk passief antibioticaresistentie. Met andere woorden, deze methoden vereisen nog steeds dat de gebruiker wacht op bacteriegroei als de laatste uitlezing.
Daarentegen hebben we een methode ontwikkeld die een combinatie van afschuiving en enzymatische stress gebruikt om antibioticagevoelige biochemische routes te activeren10. Het uitdagen van de gestreste bacteriën met die antibiotica creëert een snellere gevoeligheidstest. Bacteriën die resistent zijn tegen het antibioticum zijn bestand tegen de stressvolle omstandigheden. Gevoelige bacteriën daarentegen worden snel gedood door de gecombineerde spanningen. Het percentage celdood na een uur, gemeten door microscopie met behulp van een fluorescerende dode celvlek, definieert het fenotype van de bacterie (resistent versus vatbaar).
Voor een succesvolle implementatie van onze methode moeten bacteriën worden geïmmobiliseerd op het onderste oppervlak van het microfluïdische kanaal. Op deze manier kunnen bacteriën worden blootgesteld aan verschillende spanningen en tegelijkertijd onder een microscoop in één vlak worden afgebeeld. Een gecoate microscoopglasschuif wordt gebruikt voor bacterieimmobilisatie. De dia is door de fabrikant voorgecoat met epoxidegroepen voor niet-specifieke eiwitbinding. De aspecifieke binding van deze epoxiden aan bacteriële oppervlakte-eiwitten hecht de bacteriën covalent aan het diaoppervlak.
Stammen worden getest onder identieke omstandigheden (shear + enzymatische stress) bij afwezigheid (controle) en aanwezigheid (experiment) van antibiotica. Fasecontrast en fluorescentiemicroscoopfoto's van elk kanaal worden gedurende een uur elke twee minuten automatisch gemaakt. Resistentiebenamingen worden vervolgens gemaakt door het percentage dode bacteriën in het experimentele kanaal te vergelijken met die in het controlekanaal. Na een uur wordt een monster met een celdoodpercentage van meer dan 1% als vatbaar beschouwd, terwijl minder dan 0,5% sterfte indicatief is voor resistentie. Percentages die tussen deze twee afsnijdingen vallen, worden als onbepaald beschouwd en het monster moet opnieuw worden getest.
Microfluïdische kanalen worden gedefinieerd in PDMS, een materiaal bij uitstek voor microfluïdische apparaten11. PDMS is optisch transparant in een breed scala aan golflengten, biocompatibel, inert, doorlaatbaar voor gassen en heeft een lage permeabiliteit voor vloeistoffen; daarom is het zeer geschikt voor deze experimenten.
Mechanische/schuifspanning wordt gecreëerd door de stroom van kamertemperatuurmedia over de geïmmobiliseerde bacteriën. (Opmerking: Het opwarmen van de media tot 37 °C heeft geen significant effect op de uitkomst van de test.) Geautomatiseerde spuitpompen forceren media (met dode celvlek +/- antibioticum, evenals optionele enzymatische stressoren) door de microfluïdische kanalen (200 μm x 400 μm) met een debiet van 1 ml/min om 6,25 kPa afschuifkracht of een afschuifsnelheid van 6.000 sec-1te geven. Dit percentage is gelijk aan of hoger dan eerder bestudeerde schuifspanningen op stafylokokken.
Het enzym, lysostaphin, werd geselecteerd voor voorbereidende experimenten omdat het directe schade aan de Staphylococcus celwand veroorzaakt. De concentratie lysostaphin (0,7 ng/ml) was voldoende om bacteriële celwandschade te veroorzaken, maar niet voldoende om bacteriële celdood zonder antibioticum te veroorzaken in het tijdsbestek van het experiment. Lysostaphin is niet nodig voor de juiste aanduiding van bacteriële gevoeligheid, maar het verhoogt wel het resultaat, wat leidt tot verhoogde celdood bij gevoelige stammen. Schuifspanning daarentegen is van cruciaal belang voor de testfunctie. Wanneer methicilline-gevoelige Staphylococcus aureus stammen worden behandeld met lysostaphin en oxacilline bij afwezigheid van stroom, wordt er in de loop van het experiment geen celdood geregistreerd.
De levensvatbaarheid van de cel wordt bewaakt met een fluorescerende dode celvlek12. De selectie van de kleurstof was gebaseerd op zijn vermogen om selectief alleen beschadigde cellen te bevlekken, de niet-toxiciteit voor levende cellen en de lage fluorescentie op de achtergrond, waardoor de directe toevoeging aan de celmedia zonder extra stappen mogelijk was. De selectie van een fluorescerende kleurstofconcentratie van 0,25 μM was om aanvaardbare signaalniveaus te bereiken tijdens een blootstellingstijd van 1,6 sec aan fluorescentie-excitatielicht.
De bèta-lactam, oxacilline, werd gebruikt in onze voorstudies. Methicilline-resistente S. aureus (MRSA) soorten zijn resistent tegen oxacilline en zullen in het tijdsbestek van het experiment geen merkbare celdood vertonen. De concentratie van 50 μg/ml werd bepaald in de voorstudies. Lagere concentraties antibiotica gaven minder scheiding tussen resistente en gevoelige stammen, terwijl hogere concentraties geen merkbaar verschil in experimentele resultaten veroorzaakten.
We hebben eerder gerapporteerd over de succesvolle ontwikkeling van een test die mechanische en enzymatische spanningen combineert die de bacteriële celwand13 rechtstreeks beïnvloeden met een antibioticum dat de biosynthese van de celwand remt14,15. Deze proof-of-principle experimenten werden uitgevoerd op een panel van MRSA en methicilline-gevoelige S. aureus (MSSA). Met de selectie van de juiste experimentele parameters moet onze methode echter van toepassing zijn op meerdere soorten bacteriën en meerdere klassen antibiotica.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">SYTOX Green</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Invitrogen Corporation</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">S7020</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Dead cell fluorescence stain</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Sigma Aldrich, Inc</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">A9418-5G</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Used for lysostaphin storage</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">Sodium Acetate</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Sigma Aldrich, Inc</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">S8750-500G</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Used for lysostaphin storage</td>
		</tr>
		<tr height="98">
			<td dir="LTR" height="98" style="height:98px;width:195px;">Lysostaphin&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Cell Sciences</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">CRL309A</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Arrives as 1 mg solid. For storage: Dissolve in 20 mM sodium acetate. Mix with BSA solution to final concentration of 1% BSA and 100 &#181;g/ml &#160;lysostaphin for storage&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">Oxacillin salt</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Sigma Aldrich, Inc</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">28221-1G</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">Mueller Hinton Broth</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">DF0757-17-6</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:195px;">Sodium chloride</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Sigma Aldrixh</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">S3014-500G</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">2% added to Mueller-Hilton broth prior to autoclaving</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:195px;">1 ml, Luer-lock syringe&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">BD (Beckton, Dickinson and Comp.)</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">14-823-2F</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:195px;">2 oz, Luer-lock syringe</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">BD (Beckton, Dickinson and Comp.)</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">309653 - 60 mL</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Overfill to ~65 ml</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Microscope</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Inverted Fluoresccence Microscope Olympus IX-70</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Cambridge Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">9349</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">60X, Fluorescence/Phase contrast objective</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Olympus Corp.</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">LCPlan F1 60x/0.70 Ph2</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Retiga 12-bit monochrome CCD camera</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">QImaging</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">RET-4000R-F-M-12-C&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Microscope automation</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Shutters phase contrast/fluorescence</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">H204/H202</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">X/Y Stage&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">H107AENN</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Focus motor</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">H122</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Joystick for XYZ control</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">CS152EF</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Proscan Controller</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">H3-XY2</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Image Acquisition Software</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Flow Cell Assembly and PDMS</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Flow Cell</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1044</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;">Engineering drawings were produced by Fraunhofer CMI</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td dir="LTR" height="33" style="height:33px;width:329px;">Glass window</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1054</td>
			<td dir="LTR" rowspan="2" style="width:269px;">Glass window was cut to the proper size at Fraunhofer CMI</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td dir="LTR" height="33" style="height:33px;width:329px;">BOROFLOAT Window 50 mm x 50 mm</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Edmund Optics Inc.</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">NT48-543</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td dir="LTR" height="50" style="height:50px;width:329px;">Sealing plate</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">BU Scientific Instruments Facility</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1045</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Epoxide glass slide</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Arrayit Corporation</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">SuperEpoxy 2</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td dir="LTR" height="45" style="height:45px;width:329px;">PDMS master</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1053</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;">Master machined in aluminum or brass with UPM-0005 (ultrapresicion fly-cutting machine)</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">PDMS slide design</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1053</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Tubing</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td dir="LTR" height="50" style="height:50px;width:329px;">Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16 in, PEEK, green&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">M-644-03</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;">Flow cell inputs/outputs are tapped for this ferrule</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Ferrule, Tinytight, 1/16 in, 6-40, .030 in TH, PEEK w/ SS lock ring, black</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">M-657</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16-1/32 in, 1/4-28, PEEK, natural</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">P-255</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Ferrule, Super Falngeless, 1/16 in, Tefzel (ETFE), yellow</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">P-259</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;">Fits Luer-lock adapter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Tubing, Teflon FEP, .030 in x 1/16 in x 20 ft, green&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">1520G</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Adapter, quick connect female Luer to female 1/4-28, PEEK, red&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">P-658</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stress-induced antibiotic susceptibility testing on a chip

We hebben een snelle microfluïdische methode ontwikkeld voor het testen van de gevoeligheid van antibiotica in een stressgebaseerde omgeving. Vloeistof wordt met hoge snelheden doorgegeven over bacteriën die op de bodem van een microfluïdisch kanaal zijn geïmmobiliseerd. In aanwezigheid van stress en antibiotica sterven gevoelige bacteriestammen snel af. Resistente bacteriën overleven deze stressvolle omstandigheden echter. De hypothese achter deze methode is nieuw: stressactivatie van biochemische routes, die doelwit zijn van antibiotica, kan het testen van de gevoeligheid van antibiotica versnellen. In vergelijking met standaard antibioticagevoeligheidstestmethoden wordt de snelheidsbeperkende stap - bacteriële groei - weggelaten tijdens het aanbrengen van antibiotica. De technische implementatie van de methode is in een combinatie van standaardtechnieken en innovatieve benaderingen. De standaardonderdelen van de methode omvatten bacteriële kweekprotocollen, het definiëren van microfluïdische kanalen in polydimethylsiloxaan (PDMS), cel levensvatbaarheidsmonitoring met fluorescentie en batchbeeldverwerking voor het tellen van bacteriën. Innovatieve onderdelen van de methode zijn in het gebruik van kweekmediastroom voor mechanische stresstoepassing, gebruik van enzymen om de bacteriën te beschadigen maar niet te doden, en het gebruik van microarray substraten voor bacteriële aanhechting. Het ontwikkelde platform kan worden gebruikt bij de ontwikkeling en het testen van antibiotica en niet-antibiotische geneesmiddelen. In vergelijking met de standaard bacteriële suspensie-experimenten kan het effect van het medicijn herhaaldelijk worden in- en uitgeschakeld gedurende gecontroleerde periodes. Repetitieve observatie van dezelfde bacteriepopulatie is mogelijk in de loop van hetzelfde experiment.

De gegevens in figuur 4 tonen de respons van een gevoelige Staphylococcus aureus stam in de loop van de tijd in een antibioticumbevattend microfluïdisch kanaal. Fasecontrastbeelden die na 1 minuut en aan het einde van het 1 uur durende experiment zijn verkregen, zijn weergegeven in de figuren 4A en B. De geanalyseerde 1 uur gegevens zijn weergegeven in figuur 4C met de bacteriën gemarkeerd in rood (5.828 totaal). Overeenkomstige fluo...

Watch this Scientific Journal Video about Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip at JoVE.com

Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip

Stress-geïnduceerde antibiotica gevoeligheid testen op een chip

We hebben een microfluïdisch platform ontwikkeld voor snelle antibioticagevoeligheidstests. Vloeistof wordt met hoge snelheden doorgegeven over bacteriën die op de bodem van een microfluïdisch kanaal zijn geïmmobiliseerd. In aanwezigheid van stress en antibiotica sterven gevoelige bacteriestammen snel af. Resistente bacteriën kunnen deze stressvolle omstandigheden echter overleven.

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Lensless Fluorescent Microscopy on a Chip

Lensless fluorescentie microscopie op een chip

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for ...

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

On-Chip Endotheliale Inflammatoire Fenotypering

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

Procedure voor de ontwikkeling van multi-diepte Circulaire Cross-sectionele endotheel Microkanalen-on-a-chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

PIP-on-a-chip: een labelvrije studie van eiwit-fosfoinositide-interacties

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Droge Film elektrochemische Microfluidic Biosensor fotoresist gebaseerde Platform: Apparaat Fabrication, On-chip Assay voorbereiding en werking van het systeem

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Fabricage en validatie van een orgel-on-chip systeem met geïntegreerde elektroden te kwantificeren direct signaalcomplexen elektrische weerstand

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling

Een Lab-On-A-Chip Platform voor het stimuleren van Osteocyte Mechanotransductie en het analyseren van functionele resultaten van bone remodeling

Bone remodeling is a tightly regulated process that is required for skeletal growth and repair as well as adapting to changes in the mechanical ...

3D Cell-Printed Hypoxic Cancer-on-a-Chip for Recapitulating Pathologic Progression of Solid Cancer

3D-celgeprinte hypoxische kanker-op-een-chip voor het samenvatten van pathologische progressie van solide kanker

Cancer microenvironment has a significant impact on the progression of the disease. In particular, hypoxia is the key driver of cancer survival, invasion, ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

Generatie van een vereenvoudigd driedimensionaal huid-op-een-chip-model in een microgemachineerd microfluïdisch platform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs

Creatie van een kniegewricht-op-een-chip voor het modelleren van gewrichtsaandoeningen en het testen van medicijnen

The high prevalence of debilitating joint diseases like osteoarthritis (OA) poses a high socioeconomic burden. Currently, the available drugs that target ...