Name: stress-induced antibiotic susceptibility testing on a chip
Uploaded: 2014-01-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip at JoVE.com

אנו מודים למהנדסים ולסטודנטים במרכז פראונהופר לחדשנות בייצור. על העזרה בתכנון, עיבוד שבבי ואוטומציה של מערכת הניסוי, אנו מודים לאנדריאס פרינסן, הולגר וירז, דאג פוס, דיוויד צ'ארגין וד"ר סודונג שו. אנו מודים לג'וליה קקארץ, מלאני צימרמן, ניקו קרצמר, טים גאמבל, ג'וש ויאנואבה, מינורי שימיזו וקטרז'ינה קוליגה על העזרה בבדיקת פרוטוקולים ניסיוניים ואיסוף נתונים. אנו מכירים בד"ר אן א. קרפנטר ומארק-אנתוני בריי מפלטפורמת ההדמיה במכון ברוד של הרווארד ו-MIT לעזרה בפיתוח שגרת ניתוח התמונה ב- CellProfiler. הפרויקט המתואר נתמך בחלקו על ידי פרסים R21AI079474 ו 1R01AI101446 מהמכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות. התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את השקפותיו הרשמיות של המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות או המכונים הלאומיים לבריאות. הפרויקט נתמך גם על ידי פראונהופר ארה"ב.

1. הפוך את שכבת PDMS (איור 1)
<ol><li>מערבבים במרץ PDMS וסוכן ריפוי ביחס של 10:1. כדי להסיר בועות, degas את התערובת צמיג בתא ואקום במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>בקנה מידה, יוצקים את PDMS לאט על תבנית האלומיניום. יוצקים מהמרכז ושומרים על התבנית מאוזנת. הקפד להשאיר את הפינים חשופים. להפסיק לשפוך פעם אחת משקל ...

<ol>
	<li>Mairhofer, J., Roppert, K., Ertl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+systems+for+pathogen+sensing:+a+review.">Microfluidic systems for pathogen sensing: a review.</a> Sensors. 9, 4804-4823 (2009).</li><li>Yager, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+diagnostic+technologies+for+global+public+health.">Microfluidic diagnostic technologies for global public health.</a> Nature. 442, 412-418 (2006).</li><li>Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+bacteria+and+determining+their+susceptibility+to+antibiotics+by+stochastic+confinement+in+nanoliter+droplets+using+plug-based+microfluidics.">Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics.</a> Lab Chip. 8, 1265-1272 (2008).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+toxicological+complexity+by+multi-dimensional+screenings+in+microsegmented+flow:+modulation+of+antibiotic+interference+by+nanoparticles.">Uncovering toxicological complexity by multi-dimensional screenings in microsegmented flow: modulation of antibiotic interference by nanoparticles.</a> Lab Chip. 12, 474-484 (2012).</li><li>Chen, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+susceptibility+testing+using+high+surface-to-volume+ratio+microchannels.">Antimicrobial susceptibility testing using high surface-to-volume ratio microchannels.</a> Anal. Chem. 82, 1012-1019 (2010).</li><li>Churski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+screening+of+antibiotic+toxicity+in+an+automated+microdroplet+system.">Rapid screening of antibiotic toxicity in an automated microdroplet system.</a> Lab Chip. 12, 1629-1637 (2012).</li><li>Eun, Y. J., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulating+bacteria+in+agarose+microparticles+using+microfluidics+for+high-throughput+cell+analysis+and+isolation.">Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation.</a> ACS Chem. Biol. 6, 260-266 (2011).</li><li>Kim, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+monitoring+of+antibiotic+susceptibility+of+bacterial+biofilms+in+a+microfluidic+device.">In situ monitoring of antibiotic susceptibility of bacterial biofilms in a microfluidic device.</a> Lab Chip. 10, 3296-3299 (2010).</li><li>Peitz, I., van Leeuwen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+bacteria+growth+monitoring+by+automated+DEP-facilitated+image+analysis.">Single-cell bacteria growth monitoring by automated DEP-facilitated image analysis.</a> Lab Chip. 10, 2944-2951 (2010).</li><li>Kalashnikov, M., Lee, J. C., Campbell, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+rapid,+stress-induced+antibiotic+susceptibility+testing+of+Staphylococcus+aureus.">A microfluidic platform for rapid, stress-induced antibiotic susceptibility testing of Staphylococcus aureus.</a> Lab Chip. 12, 4523-4532 (2012).</li><li>McDonald, J. C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(dimethylsiloxane)+as+a+material+for+fabricating+microfluidic+devices.">Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices.</a> Acc. Chem. Res. 35, 491-499 (2002).</li><li>Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+viability+and+antibiotic+susceptibility+testing+with+SYTOX+green+nucleic+acid+stain.">Bacterial viability and antibiotic susceptibility testing with SYTOX green nucleic acid stain.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 2421-2431 (1997).</li><li>Francius, G., Domenech, O., Mingeot-Leclercq, M. P., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+Staphylococcus+aureus+cell+wall+digestion+by+lysostaphin.">Direct observation of Staphylococcus aureus cell wall digestion by lysostaphin.</a> J. Bacteriol. 190, 7904-7909 (2008).</li><li>Jordan, S., Hutchings, M. I., Mascher, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+envelope+stress+response+in+Gram-positive+bacteria.">Cell envelope stress response in Gram-positive bacteria.</a> FEMS Microbiol. Rev. 32, 107-146 (2008).</li><li>Koch, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+wall+as+target+for+attack:+past,+present,+and+future+research.">Bacterial wall as target for attack: past, present, and future research.</a> Clin. Microbiol. Rev. 16, 673-687 (2003).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100 (2006).</li><li>Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+antibiotics+kill+bacteria:+from+targets+to+networks.">How antibiotics kill bacteria: from targets to networks.</a> Nat. Rev. Microbiol. 8, 423-435 (2010).</li><li>Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Hayete, B., Lawrence, C. A., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+mechanism+of+cellular+death+induced+by+bactericidal+antibiotics.">A common mechanism of cellular death induced by bactericidal antibiotics.</a> Cell. 130, 797-810 (2007).</li></ol>

הפרוטוקול שהוצג אומת ואופטימיזציה בסדרה של ניסויים עם זני סטפילוקוקוס אוראוס רגישים למתיצילין ועמידים במתיצילין10. לכן, פרוטוקול זה ללא שינוי צריך להיות ישים ישירות זנים אחרים של S. aureus ואנטיביוטיקה אחרים עם מנגנונים של פעולה המשפיעים על ביוסינתזה של דופן התא החיידקי. סוגי...

עליית ההתנגדות החיידקית מגבירה את הצורך בבדיקות רגישות אנטיביוטיות מבוססות פנוטיפ מהירות על מנת להגן על התרופות שלנו של המוצא האחרון. בדיקות רגישות סטנדרטיות מבוססות על עיכוב גדילה חיידקית בנוכחות אנטיביוטיקה שלוקח כמה (8-24) שעות כדי להשלים. פיתחנו בדיקת רגישות אנטיביוטית חדשנית על פלטפורמה מיקרופלואידית המסתמכת על הפעלת מתח של מסלולים ביוסינתטיים כדי להאיץ את פעולת האנטיביוטיקה.
בדיקות רגישות לאנטיביוטיקה בקנה מידה microfluidic לשאת את היתרון של שימוש יעיל מדגם, שכן הם דורשים מספר קטן של חיידקים. בנוסף, התקנים microfluidic ניתן multiplexed על מנת לבדוק דגימות מרובות בתנאים מרובים1,2. לאחרונה, מספר שיטות microfluidic עבור בדיקות רגישות לאנטיביוטיקה דווחו3-9. בשיטות אלה, חיידקים גדלים בתוך טיפות ננו ופיקוליטר3,7, בנפח המלא של הערוץ המיקרופלואידי4-6,8, או כמו חיידקים בודדים מקומיים חשמלית על פני השטח התחתון שלהערוץ 9. למרות בדיקות אלה מתבצעות בערוצים microfluidic, כולם לפקח על צמיחה מיקרוביאלית בנוכחות והיעדר אנטיביוטיקה דומה לשיטות מסורתיות. מדידות צמיחה מתבצעות באמצעות צפיפות אופטית, צבעים רגישים ל- pH או תמונות ניגודיות או פלואורסצנטיות בהירות של שדה/פאזה. למרות שחלק מבדיקות אלה מהירות יותר משיטות מסורתיות, כל אחת מהן מזהה באופן פסיבי עמידות לאנטיביוטיקה. במילים אחרות, שיטות אלה עדיין דורשות מהמשתמש לחכות לצמיחת חיידקים כמו הקריאה הסופית.
לעומת זאת, פיתחנו שיטה המשתמשת בשילוב של גזירה ומתח אנזימטי כדי להפעיל מסלולים ביוכימיים רגישים לאנטיביוטיקה10. קריאת תיגר על החיידקים הדגיש עם אנטיביוטיקה אלה יוצרת בדיקת רגישות מהירה יותר. חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה מסוגלים לעמוד בתנאים מלחיצים. חיידקים רגישים, לעומת זאת, נהרגים במהירות על ידי הלחצים המשולבים. אחוז המוות של תאים לאחר שעה אחת, הנמדד על ידי מיקרוסקופיה באמצעות כתם תא מת פלואורסצנטי, מגדיר את הפנוטיפ של החיידקים (עמיד לעומת רגיש).
ליישום מוצלח של השיטה שלנו, חיידקים חייבים להיות משותקים על המשטח התחתון של הערוץ המיקרופלואידי. בדרך זו, חיידקים יכולים להיות נתונים ללחצים שונים ובמקביל להדמית תחת מיקרוסקופ במישור אחד. שקופית זכוכית מיקרוסקופ מצופה משמשת לשיתוק חיידקים. השקופית היא precoated על ידי היצרן עם קבוצות אפוקסיד עבור מחייב חלבון לא ספציפי. הכריכה הלא ספציפית של אפוקסידים אלה לחלבוני פני השטח החיידקיים מחברת את החיידקים למשטח השקופית.
זנים נבדקים בתנאים זהים (גזירה + מתח אנזימטי) בהיעדר (שליטה) ונוכחות (ניסוי) של אנטיביוטיקה. תמונות מיקרוסקופ של ניגודיות פאזה ופלואורסצנטיות של כל ערוץ נלקחות באופן אוטומטי כל שתי דקות למשך שעה אחת. כינויי התנגדות נעשים לאחר מכן על ידי השוואת אחוז החיידקים המתים בערוץ הניסוי לאלה הנמצאים בערוץ הבקרה. לאחר שעה אחת, מדגם עם אחוז מוות של תא גדול מ -1% נחשב רגיש, בעוד פחות מ 0.5% מוות מעיד על התנגדות. אחוזים הנכללים בין שני ניתוקים אלה נחשבים לא מוגדרים ויש לבדוק שוב את המדגם.
ערוצים מיקרופלואידיים מוגדרים ב- PDMS, שהוא חומר המועדף על מכשירים מיקרופלואידיים11. PDMS שקוף אופטית במגוון רחב של אורכי גל, תואמים ביולוגית, אינרטיים, חדירים לגזים ויש לו חדירות נמוכה לנוזלים; לכן הוא מתאים היטב לניסויים אלה.
מתח מכני/גזירה נוצר על ידי זרימת מדיית טמפרטורת החדר על פני החיידקים משותקים. (הערה: התחממות המדיה ל 37 °C (69 °F) אין השפעה משמעותית על תוצאת התסעפות.) משאבות מזרק אוטומטיות מאלצות מדיה (המכילה כתם תא מת +/- אנטיביוטי, כמו גם גורמי לחץ אנזימטיים אופציונליים) דרך הערוצים המיקרופלואידיים (200 מיקרומטר x 400 מיקרומטר) בקצב זרימה של 1 מ"ל / דקה כדי לתת 6.25 kPa של כוח גזירה או קצב גזירה של 6,000 שניות-1. שיעור זה שווה או עולה על הלחצים גזירה שנחקרו בעבר על Staphylococci.
האנזים, lysostaphin, נבחר לניסויים ראשוניים כי זה גורם נזק ישיר לקיר התא סטפילוקוקוס. הריכוז של lysostaphin (0.7 ng/ml) הספיק כדי לגרום נזק לקיר התא החיידקי, אך לא מספיק כדי לגרום למוות של תאים חיידקיים ללא אנטיביוטיקה במסגרת הזמן של הניסוי. Lysostaphin אינו נדרש לייעוד הנכון של רגישות חיידקית אבל זה להגדיל את התוצאה, המוביל מוות תאי מוגבר זנים רגישים. לעומת זאת, לחץ גזירה הוא קריטי לתפקוד מבחנים. כאשר זני סטפילוקוקוס אוראוס רגישים למתיצילין מטופלים בליזוזאפין ובאוקסצילין בהעדר זרימה, לא נרשם מוות תאי במהלך הניסוי.
הכדאיות של התא מנוטרת עם כתם תא מת פלואורסצנטי12. בחירת הצבע התבססה על יכולתו להכתים באופן סלקטיבי רק תאים פגומים, על אי-ציותו לתאים חיים ועל פלואורסצנטיות הרקע הנמוכה שלו, שאפשרה את הוספתו הישירה למדיית התאים ללא צעדים נוספים. הבחירה של ריכוז צבע פלואורסצנטי של 0.25 מיקרומטר הייתה להשיג רמות אות מקובלות במהלך זמן חשיפה של 1.6 שניות לאור עירור פלואורסצנטי.
הבטא-לקטם, אוקסצילין, שימש במחקרים הראשוניים שלנו. מינים עמידים בפני מתיצילין S. aureus (MRSA) עמידים בפני אוקסצילין ולא יראו מוות תאי ניכר במסגרת הזמן של הניסוי. הריכוז של 50 מיקרוגרם / מיליליטר נקבע במחקרים הראשוניים. ריכוזים נמוכים יותר של אנטיביוטיקה נתנו פחות הפרדה בין זנים עמידים רגישים, בעוד ריכוזים גבוהים יותר לא גרמו להבדל ניכר בתוצאות הניסוי.
דיווחנו בעבר על פיתוח מוצלח של בדיקה המשלבת לחצים מכניים ואנזימטיים המשפיעים ישירות על דופן התא החיידקי13 עם אנטיביוטיקה המעכבת את הביוסינתזה של דופן התא14,15. ניסויים אלה הוכחת העיקרון בוצעו על פאנל של MRSA ומתיצילין רגיש S. aureus (MSSA). עם זאת, עם הבחירה של פרמטרים ניסיוניים נאותים, השיטה שלנו צריכה להיות ישימה על מינים מרובים של חיידקים ומחלקות מרובות של אנטיביוטיקה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">SYTOX Green</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Invitrogen Corporation</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">S7020</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Dead cell fluorescence stain</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Sigma Aldrich, Inc</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">A9418-5G</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Used for lysostaphin storage</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">Sodium Acetate</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Sigma Aldrich, Inc</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">S8750-500G</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Used for lysostaphin storage</td>
		</tr>
		<tr height="98">
			<td dir="LTR" height="98" style="height:98px;width:195px;">Lysostaphin&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Cell Sciences</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">CRL309A</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Arrives as 1 mg solid. For storage: Dissolve in 20 mM sodium acetate. Mix with BSA solution to final concentration of 1% BSA and 100 &#181;g/ml &#160;lysostaphin for storage&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">Oxacillin salt</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Sigma Aldrich, Inc</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">28221-1G</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">Mueller Hinton Broth</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">DF0757-17-6</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:195px;">Sodium chloride</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Sigma Aldrixh</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">S3014-500G</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">2% added to Mueller-Hilton broth prior to autoclaving</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:195px;">1 ml, Luer-lock syringe&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">BD (Beckton, Dickinson and Comp.)</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">14-823-2F</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:195px;">2 oz, Luer-lock syringe</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">BD (Beckton, Dickinson and Comp.)</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">309653 - 60 mL</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Overfill to ~65 ml</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Microscope</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Inverted Fluoresccence Microscope Olympus IX-70</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Cambridge Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">9349</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">60X, Fluorescence/Phase contrast objective</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Olympus Corp.</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">LCPlan F1 60x/0.70 Ph2</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Retiga 12-bit monochrome CCD camera</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">QImaging</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">RET-4000R-F-M-12-C&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Microscope automation</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Shutters phase contrast/fluorescence</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">H204/H202</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">X/Y Stage&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">H107AENN</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Focus motor</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">H122</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Joystick for XYZ control</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">CS152EF</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Proscan Controller</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">H3-XY2</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Image Acquisition Software</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Flow Cell Assembly and PDMS</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Flow Cell</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1044</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;">Engineering drawings were produced by Fraunhofer CMI</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td dir="LTR" height="33" style="height:33px;width:329px;">Glass window</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1054</td>
			<td dir="LTR" rowspan="2" style="width:269px;">Glass window was cut to the proper size at Fraunhofer CMI</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td dir="LTR" height="33" style="height:33px;width:329px;">BOROFLOAT Window 50 mm x 50 mm</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Edmund Optics Inc.</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">NT48-543</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td dir="LTR" height="50" style="height:50px;width:329px;">Sealing plate</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">BU Scientific Instruments Facility</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1045</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Epoxide glass slide</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Arrayit Corporation</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">SuperEpoxy 2</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td dir="LTR" height="45" style="height:45px;width:329px;">PDMS master</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1053</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;">Master machined in aluminum or brass with UPM-0005 (ultrapresicion fly-cutting machine)</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">PDMS slide design</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1053</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Tubing</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td dir="LTR" height="50" style="height:50px;width:329px;">Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16 in, PEEK, green&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">M-644-03</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;">Flow cell inputs/outputs are tapped for this ferrule</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Ferrule, Tinytight, 1/16 in, 6-40, .030 in TH, PEEK w/ SS lock ring, black</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">M-657</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16-1/32 in, 1/4-28, PEEK, natural</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">P-255</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Ferrule, Super Falngeless, 1/16 in, Tefzel (ETFE), yellow</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">P-259</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;">Fits Luer-lock adapter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Tubing, Teflon FEP, .030 in x 1/16 in x 20 ft, green&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">1520G</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Adapter, quick connect female Luer to female 1/4-28, PEEK, red&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">P-658</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stress-induced antibiotic susceptibility testing on a chip

פיתחנו שיטה מיקרופלואידית מהירה לבדיקות רגישות לאנטיביוטיקה בסביבה מבוססת מתח. נוזל מועבר במהירויות גבוהות על חיידקים משותקים בתחתית ערוץ מיקרופלואידי. בנוכחות מתח ואנטיביוטיקה, זנים רגישים של חיידקים מתים במהירות. עם זאת, חיידקים עמידים לשרוד אלה תנאים מלחיצים. ההשערה מאחורי שיטה זו היא חדשה: הפעלת מתח של מסלולים ביוכימיים, שהם מטרות של אנטיביוטיקה, יכול להאיץ בדיקות רגישות לאנטיביוטיקה. בהשוואה לשיטות סטנדרטיות לבדיקת רגישות לאנטיביוטיקה, הצעד המגביל את הקצב - צמיחת חיידקים - מושמט במהלך יישום אנטיביוטי. היישום הטכני של השיטה הוא בשילוב של טכניקות סטנדרטיות וגישות חדשניות. החלקים הסטנדרטיים של השיטה כוללים פרוטוקולי תרבות חיידקים, הגדרת ערוצים מיקרופלואידיים בפולידימתילסילוקסן (PDMS), ניטור כדאיות התא עם פלואורסצנטיות ועיבוד תמונת אצווה לספירת חיידקים. חלקים חדשניים של השיטה נמצאים בשימוש בזרימת מדיה תרבותית ליישום מתח מכני, שימוש באנזימים לנזק אך לא להרוג את החיידקים, ושימוש במצעים microarray עבור התקשרות חיידקית. הפלטפורמה המפותחת יכולה לשמש בפיתוח ובדיקות של תרופות אנטיביוטיות ולא אנטיביוטיות. בהשוואה לניסויים הסטנדרטיים בהשעיית חיידקים, ניתן להדליק ולכבות את השפעת התרופה שוב ושוב על פני תקופות זמן מבוקרות. התבוננות חוזרת ונשנית באותה אוכלוסיית חיידקים אפשרית במהלך אותו ניסוי.

הנתונים המוצגים באיור 4 מראים את התגובה של זן סטפילוקוקוס אוראוס רגיש לאורך זמן בערוץ מיקרופלואידי המכיל אנטיביוטיקה. תמונות ניגודיות פאזה שנרכשו בשעה ובסוף הניסוי של שעה מוצגות באיורים 4A ו- B. הנתונים המנותחים של שעה מוצגים באיור 4C כאשר החיי...

Watch this Scientific Journal Video about Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip at JoVE.com

Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip

בדיקת רגישות אנטיביוטית הנגרמת על ידי מתח על שבב

פיתחנו פלטפורמה מיקרופלואידית לבדיקות רגישות לאנטיביוטיקה במהירות. נוזל מועבר במהירויות גבוהות על חיידקים משותקים בתחתית ערוץ מיקרופלואידי. בנוכחות מתח ואנטיביוטיקה, זנים רגישים של חיידקים מתים במהירות. עם זאת, חיידקים עמידים יכולים לשרוד את התנאים מלחיצים אלה.

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Lensless Fluorescent Microscopy on a Chip

פלורסנט מיקרוסקופית עצמים ללא עדשה על שבב

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for ...

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

על שבב phenotyping דלקתיות האנדותל

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

הליך הפיתוח של Multi-עגול עומק חתך Endothelialized microchannels-on-a-chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

PIP על שבב: מחקר ללא תווית של אינטראקציות חלבון- phosphoinositide

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

פלטפורמה מבוססת Photoresist ביוסנסור אלקטרוכימי Microfluidic הסרט יבש: ייצור המכשיר, הכנה על שבב Assay, ותפעול המערכת

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

ייצור ואימות מערכת איברים על שבב עם אלקטרודות משולבת ישירות לכמת התנגדות חשמלית Transendothelial

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling

פלטפורמת מעבדה על שבב לעירור מכניציט וניתוח תוצאות פונקציונליות של שיפוץ עצם

Bone remodeling is a tightly regulated process that is required for skeletal growth and repair as well as adapting to changes in the mechanical ...

3D Cell-Printed Hypoxic Cancer-on-a-Chip for Recapitulating Pathologic Progression of Solid Cancer

3D תא מודפס סרטן היפוקסי על שבב עבור recapitulating התקדמות פתולוגית של סרטן מוצק

Cancer microenvironment has a significant impact on the progression of the disease. In particular, hypoxia is the key driver of cancer survival, invasion, ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

יצירת דגם תלת מימדי תלת מימדי של עור על שבב בפלטפורמה מיקרופלואידית מיקרו-מכונות

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs

יצירת מפרק ברך על שבב למידול מחלות מפרקים ובדיקת תרופות

The high prevalence of debilitating joint diseases like osteoarthritis (OA) poses a high socioeconomic burden. Currently, the available drugs that target ...