Name: stress-induced antibiotic susceptibility testing on a chip
Uploaded: 2014-01-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip at JoVE.com

Vi tackar ingenjörerna och studenterna på Fraunhofer Center for Manufacturing Innovation. För att ha hjälpt till med design, bearbetning och automatisering av det experimentella systemet tackar vi Andreas Prinzen, Holger Wirz, Doug Foss, David Chargin och Dr. Sudong Shu. Vi tackar Julia Kuckartz, Melanie Zimmermann, Niko Kraetzmar, Tim Gumbel, Josh Villanueva, Minori Shimizu och Katarzyna Kuliga för hjälp med att testa experimentella protokoll och datainsamling. Vi bekräftar Drs. Anne E. Carpenter och Mark-Anthony Bray från Imaging Platform vid Broad Institute of Harvard och MIT för hjälp med utvecklingen av bildanalysrutinen i CellProfiler. Projektet som beskrevs stöddes delvis av Utmärkelser R21AI079474 och 1R01AI101446 från National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institute of Allergy and Infectious Diseases eller National Institutes of Health. Projektet stöddes också av Fraunhofer USA.

1. Gör PDMS-skiktet (bild 1)
<ol><li>Blanda PDMS och härdningsmedel kraftigt i ett 10:1-förhållande. För att ta bort bubblor avgasar viskösblandningen i en vakuumkammare i 1 timme vid rumstemperatur.</li>
	<li>På en skala häll PDMS långsamt över aluminiumformen. Häll från mitten och håll formen utjämnad. Se till att lämna stiften oskyddade. Sluta hälla när målvikten har uppnåtts. Vår form kräver 4 g PDMS och 0,4 g härdningsreagens.
</li>
	<li>Jämna ut formen i en ugn och härda vid 37...

<ol>
	<li>Mairhofer, J., Roppert, K., Ertl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+systems+for+pathogen+sensing:+a+review.">Microfluidic systems for pathogen sensing: a review.</a> Sensors. 9, 4804-4823 (2009).</li><li>Yager, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+diagnostic+technologies+for+global+public+health.">Microfluidic diagnostic technologies for global public health.</a> Nature. 442, 412-418 (2006).</li><li>Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+bacteria+and+determining+their+susceptibility+to+antibiotics+by+stochastic+confinement+in+nanoliter+droplets+using+plug-based+microfluidics.">Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics.</a> Lab Chip. 8, 1265-1272 (2008).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+toxicological+complexity+by+multi-dimensional+screenings+in+microsegmented+flow:+modulation+of+antibiotic+interference+by+nanoparticles.">Uncovering toxicological complexity by multi-dimensional screenings in microsegmented flow: modulation of antibiotic interference by nanoparticles.</a> Lab Chip. 12, 474-484 (2012).</li><li>Chen, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+susceptibility+testing+using+high+surface-to-volume+ratio+microchannels.">Antimicrobial susceptibility testing using high surface-to-volume ratio microchannels.</a> Anal. Chem. 82, 1012-1019 (2010).</li><li>Churski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+screening+of+antibiotic+toxicity+in+an+automated+microdroplet+system.">Rapid screening of antibiotic toxicity in an automated microdroplet system.</a> Lab Chip. 12, 1629-1637 (2012).</li><li>Eun, Y. J., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulating+bacteria+in+agarose+microparticles+using+microfluidics+for+high-throughput+cell+analysis+and+isolation.">Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation.</a> ACS Chem. Biol. 6, 260-266 (2011).</li><li>Kim, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+monitoring+of+antibiotic+susceptibility+of+bacterial+biofilms+in+a+microfluidic+device.">In situ monitoring of antibiotic susceptibility of bacterial biofilms in a microfluidic device.</a> Lab Chip. 10, 3296-3299 (2010).</li><li>Peitz, I., van Leeuwen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+bacteria+growth+monitoring+by+automated+DEP-facilitated+image+analysis.">Single-cell bacteria growth monitoring by automated DEP-facilitated image analysis.</a> Lab Chip. 10, 2944-2951 (2010).</li><li>Kalashnikov, M., Lee, J. C., Campbell, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+rapid,+stress-induced+antibiotic+susceptibility+testing+of+Staphylococcus+aureus.">A microfluidic platform for rapid, stress-induced antibiotic susceptibility testing of Staphylococcus aureus.</a> Lab Chip. 12, 4523-4532 (2012).</li><li>McDonald, J. C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(dimethylsiloxane)+as+a+material+for+fabricating+microfluidic+devices.">Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices.</a> Acc. Chem. Res. 35, 491-499 (2002).</li><li>Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+viability+and+antibiotic+susceptibility+testing+with+SYTOX+green+nucleic+acid+stain.">Bacterial viability and antibiotic susceptibility testing with SYTOX green nucleic acid stain.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 2421-2431 (1997).</li><li>Francius, G., Domenech, O., Mingeot-Leclercq, M. P., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+Staphylococcus+aureus+cell+wall+digestion+by+lysostaphin.">Direct observation of Staphylococcus aureus cell wall digestion by lysostaphin.</a> J. Bacteriol. 190, 7904-7909 (2008).</li><li>Jordan, S., Hutchings, M. I., Mascher, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+envelope+stress+response+in+Gram-positive+bacteria.">Cell envelope stress response in Gram-positive bacteria.</a> FEMS Microbiol. Rev. 32, 107-146 (2008).</li><li>Koch, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+wall+as+target+for+attack:+past,+present,+and+future+research.">Bacterial wall as target for attack: past, present, and future research.</a> Clin. Microbiol. Rev. 16, 673-687 (2003).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100 (2006).</li><li>Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+antibiotics+kill+bacteria:+from+targets+to+networks.">How antibiotics kill bacteria: from targets to networks.</a> Nat. Rev. Microbiol. 8, 423-435 (2010).</li><li>Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Hayete, B., Lawrence, C. A., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+mechanism+of+cellular+death+induced+by+bactericidal+antibiotics.">A common mechanism of cellular death induced by bactericidal antibiotics.</a> Cell. 130, 797-810 (2007).</li></ol>

Det presenterade protokollet validerades och optimerades i en uppsättning experiment med meticillinkänsliga och meticillinresistenta Staphylococcus aureus stammar 10. Därför bör detta protokoll utan modifiering vara direkt tillämpligt på andra stammar av S. aureus och andra antibiotika med verkningsmekanismer som påverkar bakteriell cellväggsbiosyntes. Andra bakterietyper än S. aureus kan kräva variation i stressparametrarna: lösliga (enzymatiska) och mekaniska påfrestni...

Ökningen av bakteriell resistens ökar behovet av snabba fenotypbaserade antibiotikakänslighetstester för att skydda våra läkemedel i sista utväg. Standardkänslighetstester baseras på bakteriell tillväxthämning i närvaro av antibiotika som tar flera (8-24) timmar att slutföra. Vi har utvecklat ett nytt antibiotikakänslighetstest på en mikrofluidisk plattform som förlitar sig på stressaktivering av biosyntetiska vägar för att påskynda antibiotikans verkan.
Antibiotikakänslighetstester på mikrofluidisk skala har fördelen av effektiv provanvändning, eftersom de kräver ett litet antal bakterier. Dessutom kan mikrofluidiska enheter multiplexeras för att testa flera prover under flera förhållanden1,2. Nyligen har ett antal mikrofluidiska metoder för antibiotikakänslighetstestning rapporterats3-9. I dessa metoder odlas bakterier inuti nano- och picoliterdroppar3,7, i hela volymen av den mikrofluidiska kanalen4-6,8, eller som enstaka bakterier elektriskt lokaliserade till kanal9: s bottenyta. Även om dessa tester utförs i mikrofluidiska kanaler, övervakar de alla mikrobiell tillväxt i närvaro och frånvaro av antibiotika som liknar traditionella metoder. Tillväxtmätningar görs via optisk densitet, pH-känsliga färgämnen eller ljusa fält-/faskontrast- eller fluorescensbilder. Även om vissa av dessa tester är snabbare än traditionella metoder, upptäcker de var och en passivt antibiotikaresistens. Med andra ord kräver dessa metoder fortfarande att användaren väntar på bakterietillväxt som den slutliga avläsningen.
Däremot har vi utvecklat en metod som använder en kombination av sav och enzymatisk stress för att aktivera antibiotikakänsliga biokemiska vägar10. Att utmana de stressade bakterierna med dessa antibiotika skapar ett snabbare känslighetstest. Bakterier som är resistenta mot antibiotikumet kan motstå de stressiga förhållandena. Mottagliga bakterier dödas å andra sidan snabbt av de kombinerade påfrestningarna. Andelen celldöd efter en timme, mätt med mikroskopi med hjälp av en fluorescerande död cellfläck, definierar bakterietypen fenotyp (resistent kontra mottaglig).
För en framgångsrik implementering av vår metod måste bakterier immobiliseras på den mikrofluidiska kanalens bottenyta. På så sätt kan bakterier utsättas för olika påfrestningar och samtidigt avbildas under ett mikroskop i ett enda plan. En belagd mikroskopglasrutschbana används för bakterie immobilisering. Bilden är förbelagd av tillverkaren med epoxidgrupper för ospecificerad proteinbindning. Den ospecificerade bindningen av dessa epoxider till bakteriella ytproteiner binder kovalently bakterierna till glidytan.
Stammar testas under identiska förhållanden (sav + enzymatisk stress) i frånvaro (kontroll) och förekomst (experiment) av antibiotika. Faskontrast och fluorescensmikroskopbilder av varje kanal tas automatiskt varannan minut i en timme. Resistensbeteckningar görs sedan genom att jämföra procenten av döda bakterier i den experimentella kanalen med de som finns i kontrollkanalen. Efter en timme anses ett prov med en celldödsprocent som är större än 1% vara mottagligt, medan mindre än 0,5% död tyder på resistens. Procentandelar som faller mellan dessa två brytningar anses vara obestämda och provet måste testas igen.
Mikrofluidiska kanaler definieras i PDMS, som är ett material som är val för mikrofluidiska enheter11. PDMS är optiskt transparent i ett brett spektrum av våglängder, biokompatibla, inerta, genomträngliga för gaser och har låg permeabilitet för vätskor. därför är det väl lämpat för dessa experiment.
Mekanisk/savspänning skapas av flödet av rumstemperaturmedier över de immobiliserade bakterierna. (Obs: Uppvärmning av mediet till 37 °C har ingen signifikant effekt på analysresultatet.) Automatiserade sprutpumpar tvingar media (som innehåller dödcellsfläck +/- antibiotikum, liksom valfria enzymatiska stressfaktorer) genom mikrofluidkanalerna (200 μm x 400 μm) med en flödeshastighet på 1 ml/min för att ge 6,25 kPa skjuvkraft eller en skjuvhastighet på 6 000 sek-1. Denna hastighet är lika med eller överstiger tidigare studerade savspänningar på Staphylococci.
Enzymet, lysostaphin, valdes ut för preliminära experiment eftersom det orsakar direkt skada på Staphylococcus cellvägg. Koncentrationen av lysostaphin (0,7 ng/ml) var tillräcklig för att orsaka bakteriell cellväggsskada, men inte tillräcklig för att orsaka bakteriecellsdöd utan antibiotika inom experimentet. Lysostaphin krävs inte för korrekt beteckning av bakteriell känslighet men det ökar resultatet, vilket leder till ökad celldöd hos mottagliga stammar. Däremot är savstress avgörande för analysfunktionen. När methicillinkänsliga Staphylococcus aureus-stammar behandlas med lysostaphin och oxacillin i avsaknad av flöde registreras ingen celldöd under experimentet.
Cellens livskraft övervakas med en fluorescerande död cellfläck12. Valet av färgämnet baserades på dess förmåga att selektivt färga endast skadade celler, dess icke-toxicitet till levande celler och dess låga bakgrund fluorescens, vilket tillät dess direkta tillägg till cellmediet utan ytterligare steg. Valet av en fluorescerande färgkoncentration på 0, 25 μM var att uppnå acceptabla signalnivåer under en exponeringstid på 1, 6 sekunder för fluorescens excitationsljus.
Beta-laktaam, oxacillin, användes i våra preliminära studier. Methicillinresistenta S. aureus (MRSA) arter är resistenta mot oxacillin och kommer inte att visa någon märkbar celldöd inom tidsramen för experimentet. Koncentrationen på 50 μg/ml fastställdes i förstudierna. Lägre koncentrationer av antibiotika gav mindre separation mellan resistenta och mottagliga stammar, medan högre koncentrationer inte orsakade någon märkbar skillnad i experimentella resultat.
Vi har tidigare rapporterat om framgångsrik utveckling av ett test som kombinerar mekaniska och enzymatiska påfrestningar som direkt påverkar bakteriecellväggen13 med ett antibiotikum som hämmar cellväggens biosyntes14,15. Dessa principiella experiment utfördes i en panel av MRSA och methicillin-känsliga S. aureus (MSSA). Men med valet av lämpliga experimentella parametrar bör vår metod tillämpas på flera arter av bakterier och flera klasser av antibiotika.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">SYTOX Green</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Invitrogen Corporation</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">S7020</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Dead cell fluorescence stain</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Sigma Aldrich, Inc</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">A9418-5G</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Used for lysostaphin storage</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">Sodium Acetate</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Sigma Aldrich, Inc</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">S8750-500G</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Used for lysostaphin storage</td>
		</tr>
		<tr height="98">
			<td dir="LTR" height="98" style="height:98px;width:195px;">Lysostaphin&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Cell Sciences</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">CRL309A</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Arrives as 1 mg solid. For storage: Dissolve in 20 mM sodium acetate. Mix with BSA solution to final concentration of 1% BSA and 100 &#181;g/ml &#160;lysostaphin for storage&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">Oxacillin salt</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Sigma Aldrich, Inc</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">28221-1G</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">Mueller Hinton Broth</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">DF0757-17-6</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:195px;">Sodium chloride</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Sigma Aldrixh</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">S3014-500G</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">2% added to Mueller-Hilton broth prior to autoclaving</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:195px;">1 ml, Luer-lock syringe&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">BD (Beckton, Dickinson and Comp.)</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">14-823-2F</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:195px;">2 oz, Luer-lock syringe</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">BD (Beckton, Dickinson and Comp.)</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">309653 - 60 mL</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Overfill to ~65 ml</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Microscope</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Inverted Fluoresccence Microscope Olympus IX-70</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Cambridge Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">9349</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">60X, Fluorescence/Phase contrast objective</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Olympus Corp.</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">LCPlan F1 60x/0.70 Ph2</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Retiga 12-bit monochrome CCD camera</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">QImaging</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">RET-4000R-F-M-12-C&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Microscope automation</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Shutters phase contrast/fluorescence</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">H204/H202</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">X/Y Stage&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">H107AENN</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Focus motor</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">H122</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Joystick for XYZ control</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">CS152EF</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Proscan Controller</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">H3-XY2</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Image Acquisition Software</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Flow Cell Assembly and PDMS</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Flow Cell</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1044</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;">Engineering drawings were produced by Fraunhofer CMI</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td dir="LTR" height="33" style="height:33px;width:329px;">Glass window</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1054</td>
			<td dir="LTR" rowspan="2" style="width:269px;">Glass window was cut to the proper size at Fraunhofer CMI</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td dir="LTR" height="33" style="height:33px;width:329px;">BOROFLOAT Window 50 mm x 50 mm</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Edmund Optics Inc.</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">NT48-543</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td dir="LTR" height="50" style="height:50px;width:329px;">Sealing plate</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">BU Scientific Instruments Facility</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1045</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Epoxide glass slide</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Arrayit Corporation</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">SuperEpoxy 2</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td dir="LTR" height="45" style="height:45px;width:329px;">PDMS master</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1053</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;">Master machined in aluminum or brass with UPM-0005 (ultrapresicion fly-cutting machine)</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">PDMS slide design</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1053</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Tubing</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td dir="LTR" height="50" style="height:50px;width:329px;">Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16 in, PEEK, green&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">M-644-03</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;">Flow cell inputs/outputs are tapped for this ferrule</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Ferrule, Tinytight, 1/16 in, 6-40, .030 in TH, PEEK w/ SS lock ring, black</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">M-657</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16-1/32 in, 1/4-28, PEEK, natural</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">P-255</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Ferrule, Super Falngeless, 1/16 in, Tefzel (ETFE), yellow</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">P-259</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;">Fits Luer-lock adapter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Tubing, Teflon FEP, .030 in x 1/16 in x 20 ft, green&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">1520G</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Adapter, quick connect female Luer to female 1/4-28, PEEK, red&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">P-658</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stress-induced antibiotic susceptibility testing on a chip

Vi har utvecklat en snabb mikrofluidisk metod för antibiotikakänslighetstestning i en stressbaserad miljö. Vätska passeras i höga hastigheter över bakterier immobiliserade på botten av en mikrofluidisk kanal. I närvaro av stress och antibiotika dör mottagliga bakteriestammar snabbt. Resistenta bakterier överlever dock dessa stressiga förhållanden. Hypotesen bakom denna metod är ny: stressaktivering av biokemiska vägar, som är mål för antibiotika, kan påskynda testning av antibiotikakänslighet. Jämfört med vanliga metoder för testning av antibiotikakänslighet utelämnas det hastighetsbegränsande steget - bakterietillväxt - under antibiotikaapplikationen. Det tekniska genomförandet av metoden är i en kombination av standardtekniker och innovativa tillvägagångssätt. Standarddelarna i metoden inkluderar bakteriekulturprotokoll, definition av mikrofluidkanaler i polydietylsiloxan (PDMS), celllivskraftsövervakning med fluorescens och batchbildbehandling för bakterieräkning. Innovativa delar av metoden används i odlingsmedieflödet för mekanisk stressapplikation, användning av enzymer för att skada men inte döda bakterierna och användning av mikroarraysubstrat för bakteriell fastsättning. Den utvecklade plattformen kan användas i antibiotika och icke-antibiotisk relaterad läkemedelsutveckling och testning. Jämfört med de vanliga bakteriella suspensionsexperimenten kan effekten av läkemedlet aktiveras och inaktiveras upprepade gånger under kontrollerade tidsperioder. Repetitiv observation av samma bakteriepopulation är möjlig under samma experiment.

De data som presenteras i figur 4 visar svaret från en mottaglig Staphylococcus aureus stam över tid i en antibiotikainnehållande mikrofluidisk kanal. Faskontrastbilder som förvärvats vid 1 min och i slutet av 1 timmes experiment visas i figurerna 4A och B. De analyserade 1 timdata visas i figur 4C med bakterierna markerade i rött (5 828 totalt). Motsvarande fluorescensbilder visas i figurerna 4D och E</s...

Watch this Scientific Journal Video about Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip at JoVE.com

Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip

Stressinducerad antibiotikakänslighetstestning på ett chip

Vi har utvecklat en mikrofluidisk plattform för snabb antibiotikakänslighetstestning. Vätska passeras i höga hastigheter över bakterier immobiliserade på botten av en mikrofluidisk kanal. I närvaro av stress och antibiotika dör mottagliga bakteriestammar snabbt. Resistenta bakterier kan dock överleva dessa stressiga förhållanden.

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Lensless Fluorescent Microscopy on a Chip

Lensless Fluorescerande Mikroskopi on a Chip

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for ...

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

On-Chip Endothelial inflammatorisk Fenotypning

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

Förfarandet för utarbetande av Multi-djup Cirkulär Tvärsnitt Endothelialized mikrokanalerna-on-a-chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

PIP-on-a-chip: En etikettfri studie av protein-fosfinositid-interaktioner

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Torr Film fotoresist-baserade elektrokemiska mikroflödessystem Biosensor plattform: Enhet Fabrication, On-chip Assay förberedelse och systemdrift

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Tillverkning och validering av en orgel-on-chip System med integrerad elektroder direkt kvantifiera Transendothelial resistans

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling

En Lab-On-A-Chip plattform för att stimulera osteocyte Mechanotransduktion och analysera funktionella resultat av ben remodeling

Bone remodeling is a tightly regulated process that is required for skeletal growth and repair as well as adapting to changes in the mechanical ...

3D Cell-Printed Hypoxic Cancer-on-a-Chip for Recapitulating Pathologic Progression of Solid Cancer

3D-cellstryckt hypoxisk cancer-på-ett-chip för rekapitlatering av patologisk progression av fast cancer

Cancer microenvironment has a significant impact on the progression of the disease. In particular, hypoxia is the key driver of cancer survival, invasion, ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

Generering av en förenklad tredimensionell hud-på-ett-chip-modell i en mikromaskin mikrofluidisk plattform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs

Skapande av en knäled-på-ett-chip för modellering av ledsjukdomar och testning av läkemedel

The high prevalence of debilitating joint diseases like osteoarthritis (OA) poses a high socioeconomic burden. Currently, the available drugs that target ...