Name: organelle transport in cultured drosophila cells: s2 cell line and primary neurons.
Uploaded: 2013-11-20T18:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons. at JoVE.com

Wij danken de leden van de Gelfand lab die de ontwikkeling van deze protocollen bijgedragen. Onderzoek gemeld in deze publicatie werd gesteund door het Nationale Instituut van Algemene Medische Wetenschappen van de National Institutes of Health onder nummer award R01GM052111 aan VIG en door Baskische regering Ministerie van Onderwijs, Universiteiten en Onderzoek onder nummer award BFI-2011-295 tot UDC.

1. Drosophila S2 cellen <ol><li> Bereiding van ConA beklede dekglaasjes <ol><li> Plaats dekglaasjes in een keramische rek en wassen met chroomzuur onderdompeling gedurende 1 uur. [LET OP: chroomzuur is bijtend en kan irritatie van ogen, neus, keel en huid veroorzaken]. </li><li> Spoel coverslips grondig met constant lopende dH 2 O gedurende 30 min, totdat het zuur volledig wordt uitgewassen. </li><li> Laat dekglaasjes drogen en coaten met ConA (0,5 mg / ml oplossing dH <sub...

<ol>
	<li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster.">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 27, 353-365 (1972).</li><li>Rogers, S. L., Rogers, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Drosophila+S2+cells+and+their+use+for+RNAi-mediated+loss-of-function+studies+and+immunofluorescence.">Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence.</a> 3, 606-611 (2008).</li><li>Buster, D. W., Nye, J., Klebba, J. E., Rogers, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Drosophila+S2+cells+for+light+microscopy.">Preparation of Drosophila S2 cells for light microscopy.</a> J. Vis. Exp. (40), e1982 (2010).</li><li>Ling, S. C., Fahrner, P. S., Greenough, W. T., Gelfand, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+Drosophila+fragile+X+mental+retardation+protein-containing+ribonucleoprotein+granules+by+kinesin-1+and+cytoplasmic+dynein.">Transport of Drosophila fragile X mental retardation protein-containing ribonucleoprotein granules by kinesin-1 and cytoplasmic dynein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17428-17433 (2004).</li><li>Kural, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+and+dynein+move+a+peroxisome+in+vivo:+a+tug-of-war+or+coordinated+movement.">Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement.</a> Science. 308, 1469-1472 (2005).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+binding+by+dynactin+is+required+for+microtubule+organization+but+not+cargo+transport.">Microtubule binding by dynactin is required for microtubule organization but not cargo transport.</a> J. Cell. Biol. 176, 641-651 (2007).</li><li>Ally, S., Larson, A. G., Barlan, K., Rice, S. E., Gelfand, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite-polarity+motors+activate+one+another+to+trigger+cargo+transport+in+live+cells.">Opposite-polarity motors activate one another to trigger cargo transport in live cells.</a> J. Cell. Biol. 187, 1071-1082 (2009).</li><li>Bensenor, L. B., Barlan, K., Rice, S. E., Fehon, R. G., Gelfand, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-mediated+transport+of+the+tumor-suppressor+protein+Merlin+and+its+mutants.">Microtubule-mediated transport of the tumor-suppressor protein Merlin and its mutants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 7311-7316 (2010).</li><li>Jolly, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1+heavy+chain+mediates+microtubule+sliding+to+drive+changes+in+cell+shape.">Kinesin-1 heavy chain mediates microtubule sliding to drive changes in cell shape.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 12151-12156 (2010).</li><li>Barlan, K., Lu, W., Gelfand, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microtubule-binding+protein+ensconsin+is+an+essential+cofactor+of+Kinesin-1.">The microtubule-binding protein ensconsin is an essential cofactor of Kinesin-1.</a> Curr. Biol. 23, 317-322 (2013).</li><li>Lu, W., Fox, P., Lakonishok, M., Davidson, M. W., Gelfand, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+Neurite+Outgrowth+in+Drosophila+Neurons+Is+Driven+by+Kinesin-Powered+Microtubule+Sliding.">Initial Neurite Outgrowth in Drosophila Neurons Is Driven by Kinesin-Powered Microtubule Sliding.</a> Curr. Biol. 23, 1018-1023 (2013).</li><li>Pathak, D., Sepp, K. J., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+myosin+activity+opposes+microtubule-based+axonal+transport+of+mitochondria.">Evidence that myosin activity opposes microtubule-based axonal transport of mitochondria.</a> J. Neurosci. 30, 8984-8992 (2010).</li><li>Clark, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+pink1+is+required+for+mitochondrial+function+and+interacts+genetically+with+parkin.">Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin.</a> Nature. 441, 1162-1166 (2006).</li><li>Gunawardena, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+axonal+transport+by+loss+of+huntingtin+or+expression+of+pathogenic+polyQ+proteins+in+Drosophila.">Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila.</a> Neuron. 40, 25-40 (2003).</li><li>Koo, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precursor+of+amyloid+protein+in+Alzheimer+disease+undergoes+fast+anterograde+axonal+transport.">Precursor of amyloid protein in Alzheimer disease undergoes fast anterograde axonal transport.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1561-1565 (1990).</li><li>Stokin, G. B., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+and+Alzheimer's+disease.">Axonal transport and Alzheimer's disease.</a> Annu. Rev. Biochem. 75, 607-627 (2006).</li><li>Bilsland, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficits+in+axonal+transport+precede+ALS+symptoms+in+vivo.">Deficits in axonal transport precede ALS symptoms in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20523-20528 (2010).</li><li>Lloyd, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p150(Glued)+CAP-Gly+domain+regulates+initiation+of+retrograde+transport+at+synaptic+termini.">The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini.</a> Neuron. 74, 344-360 (2012).</li><li>Moughamian, A. J., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynactin+is+required+for+transport+initiation+from+the+distal+axon.">Dynactin is required for transport initiation from the distal axon.</a> Neuron. 74, 331-343 (2012).</li><li>Lorenzo, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrin+mutations+that+cause+spinocerebellar+ataxia+type+5+impair+axonal+transport+and+induce+neurodegeneration+in+Drosophila.">Spectrin mutations that cause spinocerebellar ataxia type 5 impair axonal transport and induce neurodegeneration in Drosophila.</a> J. Cell. Biol. 189, 143-158 (2010).</li><li>Robinow, S., White, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+locus+elav+of+Drosophila+melanogaster+is+expressed+in+neurons+at+all+developmental+stages.">The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages.</a> Dev. Biol. 126, 294-303 (1988).</li><li>Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1+and+Dynein+are+the+primary+motors+for+fast+transport+of+mitochondria+in+Drosophila+motor+axons.">Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).</li><li>Furst, A., Mahowald, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+primary+embryonic+neuroblasts+in+purified+neural+cell+cultures+from+Drosophila.">Differentiation of primary embryonic neuroblasts in purified neural cell cultures from Drosophila.</a> Dev. Biol. 109, 184-192 (1985).</li><li>Salvaterra, P. M., Bournias-Vardiabasis, N., Nair, T., Hou, G., Lieu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+neuronal+differentiation+of+Drosophila+embryo+cells.">In vitro neuronal differentiation of Drosophila embryo cells.</a> J. Neurosci. 7, 10-22 (1987).</li><li>Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+peroxisomal+compartment+in+living+mammalian+cells:+dynamic+behavior+and+association+with+microtubules.">Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules.</a> J. Cell. Biol. 136, 71-80 (1997).</li><li>Rizzuto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+specifying+subunit+VIII+of+human+cytochrome+c+oxidase+is+localized+to+chromosome+11+and+is+expressed+in+both+muscle+and+non-muscle+tissues.">A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues.</a> J. Biol. Chem. 264, 10595-10600 (1989).</li><li>Poot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+morphology+and+function+with+novel+fixable+fluorescent+stains.">Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains.</a> J. Histochem. Cytochem. 44, 1363-1372 (1996).</li><li>Haller, T., Dietl, P., Deetjen, P., Volkl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lysosomal+compartment+as+intracellular+calcium+store+in+MDCK+cells:+a+possible+involvement+in+InsP3-mediated+Ca2++release.">The lysosomal compartment as intracellular calcium store in MDCK cells: a possible involvement in InsP3-mediated Ca2+ release.</a> Cell Calcium. 19, 157-165 (1996).</li></ol>

Hier presenteren we gedetailleerde protocollen voor het bestuderen van microtubuli-afhankelijke goederenvervoer in Drosophila S2 cellen en primaire neuron cultuur. Zowel S2 processen en neurites zijn structuren opgevuld door gebundelde microtubuli arrays die dienen als tracks voor organel transport. Twee strategieën worden gewoonlijk gebruikt om label organellen: transfectie van vectoren die coderen voor een fluorescerend eiwit met een organel doelsequentie of kleuring met fluoresc...

Drosophila S2 cellen hebben opgedaan toenemende populariteit voor het bestuderen van vele cellulaire processen. Deze cellen werden oorspronkelijk verkregen van getrypsineerd laat stadium embryo&#39;s van OregonR Drosophila melanogaster en onderhouden van macrofaag-achtige functies 1. Drosophila S2 cellen bieden vele voordelen ten opzichte van andere cellijnen. Ze worden gekweekt bij 25 ° C zonder CO2 en kunnen worden afgebeeld vele uren bij kamertemperatuur zonder verwarming of gasuitwisseling. Belangrijker Drosophila S2 cellen zijn zeer gevoelig voor RNAi behandeling waardoor hoge rendement knockdown van eiwitten van belang. S2-cellen zijn zeer transfecteerbare en stabiele cellijnen kunnen worden geselecteerd in minder dan vier weken stabiele ectopische expressie van eiwitten van belang mogelijk. S2 cellen normaal te laten groeien ofwel losjes verbonden, maar niet verspreid op een fles of in suspensie. Ze kunnen worden geïnduceerd te verspreiden op dekglaasjes van tevoren met een plant lectine Concanavalin A (ConA). De omtrek van de verspreiding cellen is bijzonder dun en daarom ideaal voor levende cel microscopie. Gedetailleerde protocollen voor S2 cellen cultuur, RNAi behandeling, levende licht beeldvorming en immunostaining kan worden gevonden in de literatuur 2,3. Ons laboratorium heeft S2 cellen aangenomen als een modelsysteem voor de microtubuli-gebaseerde vrachtvervoer bestuderen. Drosophila S2 cellen behandeld met een geneesmiddel dat depolymeriseert of verbreekt F-actine, zoals cytochalasine D (CytoD), groeien lange processen gevuld met uniform gepolariseerde microtubuli 4 -10, waardoor het een ideaal systeem om lading beweging bestudeerd langs microtubuli arrays maakt. Verschillende parameters van transport in deze processen (. Dwz trajecten lengte, snelheden, richtinggevoeligheid enz.) kan gemakkelijk worden gemeten met behulp van geautomatiseerde deeltje tracking software, DiaTrack (Semasopht: http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423; Dr . Pascal Vallotton: http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-Informatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx # a4). Deze eigenschappen maken S2 cellen een aantrekkelijk systeem voor het bestuderen van vrachtvervoer langs microtubuli in weefselkweek cellen. Proefprojecten in S2 cellen kunnen worden uitgebreid tot een fysiologisch belangrijk model van studies vrachtvervoer in Drosophila primaire neuronen. Net als S2-cellen, neuronen gekweekt uit gedissocieerde embryo&#39;s permeabel voor kleine moleculen zoals kleurstoffen en inhibitoren en hoge-resolutie beeldvorming van levende organel transport kan worden uitgevoerd in neuronen bij kamertemperatuur. Met behulp van Drosophila met verschillende genetische achtergronden, kunnen we gen-functie onderzoeken in primaire neuronen door knock-out (genetische verlies-van-functie mutaties), knock-down (dsRNA injectie of expressie) of ectopische expressie (transgene vliegen). Concreet betekent versnippering van actine filamenten gebruik CytoD behandeling belet niet dat neurietuitgroei, in plaats daarvan sneller groeien ze, en dus kunnen we bestuderen microtubuli-dependent organel transport in CytoD behandelde neuronen zonder de invloed van actine filamenten 11. Daarom primaire neuronale culturen combineren de voordelen van weefselkweek cellen en vliegen genetica, waardoor het een geweldig systeem om vrachtvervoer studeren in een fysiologisch relevante systeem 10,12 maakt. Sinds enkele familiale neurodegeneratieve ziekten kunnen worden veroorzaakt door of in verband met gebreken vracht vervoer (bijvoorbeeld de ziekte van Parkinson 13, de ziekte van Huntington 14, Ziekte van Alzheimer 15,16, amyotrofische laterale sclerose / ALS 17 HMN7B en Perry syndroom 18,19 en Spinocerebellaire soort ataxie 5/SCA5 20), kan de primaire neuronale culturen bruikbaar in de analyse van de effecten van specifieke mutaties veroorzaken deze ziekten voor de microtubuli-afhankelijke vervoer. Tenslotte worden belangrijke eigenschappen van microtubuli-afhankelijk transport goed geconserveerd tussen zoogdieren en vliegen, maar <em&gt; Drosophila genetische en celkweek minder duur en tijdrovend, die het gebruik van gekweekte Drosophila-cellen te bestuderen essentiële aspecten van organel transport in normale en pathologische omstandigheden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="435">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:124px;">Powder Insect cell medium (Schneider&#8217;s)</td>
			<td style="width:133px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:179px;">S9895</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:124px;">Insect &#8211;Xpress medium</td>
			<td style="width:133px;">Fisher</td>
			<td style="width:179px;">BW12730Q</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:124px;">Insulin</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:179px;">I6634</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:124px;">Penicillin</td>
			<td style="width:133px;">Research Products International</td>
			<td style="width:179px;">P93000</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:124px;">Streptomycin</td>
			<td style="width:133px;">Research Products International</td>
			<td style="width:179px;">S62000</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:124px;">Tetracycline hydrochloride</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:179px;">T7660-5G</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:124px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:133px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:179px;">S11150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:124px;">Concanavalin A</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:179px;">C2010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:124px;">Cytochalasin D</td>
			<td style="width:133px;">VWR</td>
			<td style="width:179px;">IC15077105</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:124px;">LysoTracker Red DND-99</td>
			<td style="width:133px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:179px;">L7528</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:124px;">100 &#181;m Cell strainer</td>
			<td style="width:133px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:179px;">22363549</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:124px;">25 mm Circle cover glass</td>
			<td style="width:133px;">VWR</td>
			<td style="width:179px;">48380 080</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:124px;">Drosophila Vials</td>
			<td style="width:133px;">VWR</td>
			<td style="width:179px;">89092-730</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:124px;">Disposable pellet pestles with matching microtubes</td>
			<td style="width:133px;">Kimble Chase</td>
			<td style="width:179px;">749520-0000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organelle transport in cultured drosophila cells: s2 cell line and primary neurons.

Drosophila S2 cellen op een dekglaasje in aanwezigheid van een actine-depolymeriseren geneesmiddelvorm lange onvertakte werkwijzen vol uniform gepolariseerd microtubuli. Organellen bewegen langs deze processen microtubule motoren. Gemakkelijk onderhoud, hoge gevoeligheid voor RNAi-gemedieerde proteïne knock-down en efficiënte procedure voor het maken van stabiele cellijnen Drosophila S2 cellen ideale modelsysteem vrachtvervoer bestuderen door levende beeldvorming. De met S2 cellen resultaten kunnen verder worden aangebracht op een fysiologisch relevante systeem: axonaal transport in primaire neuronen gekweekt uit gedissocieerde Drosophila embryo. Gekweekte neuronen groeien lange neurites gevuld met gebundelde microtubuli, zeer vergelijkbaar met S2 processen. Zoals in S2-cellen, organellen in gekweekte neuronen kan worden gevisualiseerd door een organel-specifieke fluorescente kleurstoffen of met fluorescente merkers organel gecodeerd door DNA geïnjecteerd in vroege embryo&#39;s of uitgedrukt in transgeneic vliegt. Daarom kan organel transport eenvoudig worden opgenomen in neuronen gekweekt op dekglaasjes met levende beeldvorming. Hier beschrijven we de procedures voor het kweken en visualiseren van het vrachtvervoer in Drosophila S2 cellen en primaire neuronen. Wij geloven dat deze protocollen maken beide systemen toegankelijk voor laboratoria bestuderen vrachtvervoer.

Drosophila S2 cellen bevestigd aan de ConA-gecoate dekglaasje uitgespreid in een platte ronde &quot;pannenkoek&quot;-vorm (figuren 1A en 1C). Wanneer S2 cellen op dekglaasjes in aanwezigheid van CytoD en mogen verspreiden 2-3 uur, vormen ze lange dunne processen voorzien door parallelle microtubuli (Figuren 1B en 1D). Deze microtubuli hebben een uniforme polariteit met plus-ends uit 7. Time-lapse fluorescentie beeldvorming van Dr...

Watch this Scientific Journal Video about Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons. at JoVE.com

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cellen en gekweekte neuronen zijn zeer geschikt voor beeldvorming van motor aangedreven organel transport in vivo. Hier beschrijven we gedetailleerde protocollen voor het kweken van beide celtypen, hun beeldvorming en analyse van het vervoer.

Organel Transport in gekweekte<em&gt; Drosophila</em&gt; Cellen: S2 cellijn en primaire neuronen.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Research

JoVE Journal

Biology

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

Het meten van exocytose in Neuronen FM-ontvanger voor Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

Primaire neuronale culturen uit de hersenen van laat stadium Drosophila Poppen

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

Live-Imaging van dicht-core Blaasjes in het jeugdwerk Gekweekte hippocampale neuronen

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

De voorbereiding van Drosophila S2 cellen voor lichtmicroscopie

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Primaire celculturen van Drosophila Gastrula Embryo&#39;s

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolatie en Primaire Cultuur van Rat levercellen

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Wonen Imaging van apoptotische cel Clearance tijdens<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Het genereren van een &quot;gehumaniseerde&quot;<em&gt; Drosophila</em&gt; S2 cellijn Gevoelig voor farmacologische remming van Kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Een grafische gebruikersinterface voor software-assisted tracking van eiwitconcentratie in dynamische cellulaire protrusies

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Glucoseopname-meting en respons op insuline stimulatie in<em&gt; In Vitro</em&gt; Cultured Human Primary Myotubes

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...