Name: organelle transport in cultured drosophila cells: s2 cell line and primary neurons.
Uploaded: 2013-11-20T18:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons. at JoVE.com

Agradecemos a los miembros del laboratorio de Gelfand que contribuyeron al desarrollo de estos protocolos. Las investigaciones realizadas en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de la Salud bajo el número de concesión R01GM052111 a VIG y por el Departamento del Gobierno Vasco de Educación, Universidades e Investigación con el número premio BFI-2011-295 a UdC.

1. Células S2 de Drosophila <ol><li> Preparación de cubreobjetos recubiertos de ConA <ol><li> Coloque cubreobjetos en un bastidor de cerámica y lavarlos por inmersión en ácido crómico durante 1 hora. [ATENCION: El ácido crómico es corrosivo y puede provocar irritación de los ojos, la nariz, la garganta y la piel]. </li><li> Enjuagar a fondo con cubreobjetos en constante funcionamiento dH 2 O durante 30 minutos hasta que el ácido está completamente lavada. </li><l...

<ol>
	<li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster.">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 27, 353-365 (1972).</li><li>Rogers, S. L., Rogers, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Drosophila+S2+cells+and+their+use+for+RNAi-mediated+loss-of-function+studies+and+immunofluorescence.">Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence.</a> 3, 606-611 (2008).</li><li>Buster, D. W., Nye, J., Klebba, J. E., Rogers, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Drosophila+S2+cells+for+light+microscopy.">Preparation of Drosophila S2 cells for light microscopy.</a> J. Vis. Exp. (40), e1982 (2010).</li><li>Ling, S. C., Fahrner, P. S., Greenough, W. T., Gelfand, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+Drosophila+fragile+X+mental+retardation+protein-containing+ribonucleoprotein+granules+by+kinesin-1+and+cytoplasmic+dynein.">Transport of Drosophila fragile X mental retardation protein-containing ribonucleoprotein granules by kinesin-1 and cytoplasmic dynein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17428-17433 (2004).</li><li>Kural, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+and+dynein+move+a+peroxisome+in+vivo:+a+tug-of-war+or+coordinated+movement.">Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement.</a> Science. 308, 1469-1472 (2005).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+binding+by+dynactin+is+required+for+microtubule+organization+but+not+cargo+transport.">Microtubule binding by dynactin is required for microtubule organization but not cargo transport.</a> J. Cell. Biol. 176, 641-651 (2007).</li><li>Ally, S., Larson, A. G., Barlan, K., Rice, S. E., Gelfand, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite-polarity+motors+activate+one+another+to+trigger+cargo+transport+in+live+cells.">Opposite-polarity motors activate one another to trigger cargo transport in live cells.</a> J. Cell. Biol. 187, 1071-1082 (2009).</li><li>Bensenor, L. B., Barlan, K., Rice, S. E., Fehon, R. G., Gelfand, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-mediated+transport+of+the+tumor-suppressor+protein+Merlin+and+its+mutants.">Microtubule-mediated transport of the tumor-suppressor protein Merlin and its mutants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 7311-7316 (2010).</li><li>Jolly, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1+heavy+chain+mediates+microtubule+sliding+to+drive+changes+in+cell+shape.">Kinesin-1 heavy chain mediates microtubule sliding to drive changes in cell shape.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 12151-12156 (2010).</li><li>Barlan, K., Lu, W., Gelfand, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microtubule-binding+protein+ensconsin+is+an+essential+cofactor+of+Kinesin-1.">The microtubule-binding protein ensconsin is an essential cofactor of Kinesin-1.</a> Curr. Biol. 23, 317-322 (2013).</li><li>Lu, W., Fox, P., Lakonishok, M., Davidson, M. W., Gelfand, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+Neurite+Outgrowth+in+Drosophila+Neurons+Is+Driven+by+Kinesin-Powered+Microtubule+Sliding.">Initial Neurite Outgrowth in Drosophila Neurons Is Driven by Kinesin-Powered Microtubule Sliding.</a> Curr. Biol. 23, 1018-1023 (2013).</li><li>Pathak, D., Sepp, K. J., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+myosin+activity+opposes+microtubule-based+axonal+transport+of+mitochondria.">Evidence that myosin activity opposes microtubule-based axonal transport of mitochondria.</a> J. Neurosci. 30, 8984-8992 (2010).</li><li>Clark, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+pink1+is+required+for+mitochondrial+function+and+interacts+genetically+with+parkin.">Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin.</a> Nature. 441, 1162-1166 (2006).</li><li>Gunawardena, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+axonal+transport+by+loss+of+huntingtin+or+expression+of+pathogenic+polyQ+proteins+in+Drosophila.">Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila.</a> Neuron. 40, 25-40 (2003).</li><li>Koo, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precursor+of+amyloid+protein+in+Alzheimer+disease+undergoes+fast+anterograde+axonal+transport.">Precursor of amyloid protein in Alzheimer disease undergoes fast anterograde axonal transport.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1561-1565 (1990).</li><li>Stokin, G. B., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+and+Alzheimer's+disease.">Axonal transport and Alzheimer's disease.</a> Annu. Rev. Biochem. 75, 607-627 (2006).</li><li>Bilsland, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficits+in+axonal+transport+precede+ALS+symptoms+in+vivo.">Deficits in axonal transport precede ALS symptoms in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20523-20528 (2010).</li><li>Lloyd, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p150(Glued)+CAP-Gly+domain+regulates+initiation+of+retrograde+transport+at+synaptic+termini.">The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini.</a> Neuron. 74, 344-360 (2012).</li><li>Moughamian, A. J., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynactin+is+required+for+transport+initiation+from+the+distal+axon.">Dynactin is required for transport initiation from the distal axon.</a> Neuron. 74, 331-343 (2012).</li><li>Lorenzo, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrin+mutations+that+cause+spinocerebellar+ataxia+type+5+impair+axonal+transport+and+induce+neurodegeneration+in+Drosophila.">Spectrin mutations that cause spinocerebellar ataxia type 5 impair axonal transport and induce neurodegeneration in Drosophila.</a> J. Cell. Biol. 189, 143-158 (2010).</li><li>Robinow, S., White, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+locus+elav+of+Drosophila+melanogaster+is+expressed+in+neurons+at+all+developmental+stages.">The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages.</a> Dev. Biol. 126, 294-303 (1988).</li><li>Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1+and+Dynein+are+the+primary+motors+for+fast+transport+of+mitochondria+in+Drosophila+motor+axons.">Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).</li><li>Furst, A., Mahowald, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+primary+embryonic+neuroblasts+in+purified+neural+cell+cultures+from+Drosophila.">Differentiation of primary embryonic neuroblasts in purified neural cell cultures from Drosophila.</a> Dev. Biol. 109, 184-192 (1985).</li><li>Salvaterra, P. M., Bournias-Vardiabasis, N., Nair, T., Hou, G., Lieu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+neuronal+differentiation+of+Drosophila+embryo+cells.">In vitro neuronal differentiation of Drosophila embryo cells.</a> J. Neurosci. 7, 10-22 (1987).</li><li>Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+peroxisomal+compartment+in+living+mammalian+cells:+dynamic+behavior+and+association+with+microtubules.">Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules.</a> J. Cell. Biol. 136, 71-80 (1997).</li><li>Rizzuto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+specifying+subunit+VIII+of+human+cytochrome+c+oxidase+is+localized+to+chromosome+11+and+is+expressed+in+both+muscle+and+non-muscle+tissues.">A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues.</a> J. Biol. Chem. 264, 10595-10600 (1989).</li><li>Poot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+morphology+and+function+with+novel+fixable+fluorescent+stains.">Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains.</a> J. Histochem. Cytochem. 44, 1363-1372 (1996).</li><li>Haller, T., Dietl, P., Deetjen, P., Volkl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lysosomal+compartment+as+intracellular+calcium+store+in+MDCK+cells:+a+possible+involvement+in+InsP3-mediated+Ca2++release.">The lysosomal compartment as intracellular calcium store in MDCK cells: a possible involvement in InsP3-mediated Ca2+ release.</a> Cell Calcium. 19, 157-165 (1996).</li></ol>

Aquí presentamos los protocolos detallados para estudiar el transporte de carga dependiente de microtúbulos en las células S2 de Drosophila y la cultura de la neurona primaria. Ambos procesos y neuritas S2 son estructuras llenas de paquetes de microtúbulos arrays que sirven como pistas para el transporte de orgánulos. Dos estrategias se utilizan típicamente a orgánulos de la etiqueta: la transfección de vectores que codifican una proteína fluorescente con una secuencia de o...

Células S2 de Drosophila han ganado cada vez más popularidad para el estudio de muchos procesos celulares. Estas células se obtuvieron originalmente de tripsinizadas embriones en fase tardía de OregonR Drosophila melanogaster y mantienen características similares a los macrófagos 1. Células S2 de Drosophila ofrecen muchas ventajas sobre otras líneas celulares. Ellos se cultivan a 25 ° C sin CO 2, y se pueden obtener imágenes para muchas horas a temperatura ambiente sin la necesidad de calefacción o el intercambio de gases. Más importante aún, las células S2 de Drosophila son muy sensibles al tratamiento de RNAi desmontables permitiendo alta eficiencia de proteínas de interés. Células S2 son altamente transfectables y líneas celulares estables se pueden seleccionar en menos de cuatro semanas para permitir la expresión ectópica estable de proteínas de interés. S2 células crecen normalmente bien vagamente unidos pero no se diseminan en un frasco o en suspensión. Ellos pueden ser inducidas a propagarse en cubreobjetos recubiertos previamente con un Conca lectina plantaNavalin A (ConA). La periferia de las células propagadas es especialmente fina y por lo tanto es ideal para microscopia de células vivas. Protocolos detallados para el cultivo las células S2, el tratamiento de RNAi, las imágenes en directo y de inmunotinción se pueden encontrar en la literatura 2,3. Nuestro laboratorio ha adoptado células S2 como un sistema modelo para estudiar el transporte de carga a base de microtúbulos. Células S2 de Drosophila tratados con cualquier fármaco que despolimeriza o corta la F-actina, tales como citocalasina D (CytoD), crecen los procesos largos llenos de microtúbulos uniformemente polarizadas 4 -10, lo que lo convierte en un sistema ideal para estudiar el movimiento de carga a lo largo de los microtúbulos arrays. Diferentes parámetros de transporte en estos procesos (es decir. Trayectorias longitudes, velocidades, direccionalidad, etc) se pueden medir fácilmente utilizando el software de partículas de seguimiento automatizado, DiaTrack (Semasopht: http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423; Dr. . Pascal Vallotton: http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-Informatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx # A4). Estas propiedades hacen que las células S2 un sistema atractivo para el estudio de transporte de carga a lo largo de los microtúbulos en células de cultivo de tejidos. Los experimentos piloto en células S2 se pueden extender a un modelo fisiológicamente importante de los estudios de transporte de carga en las neuronas primarias de Drosophila. De manera similar a las células S2, neuronas cultivadas a partir de embriones disociadas son permeables a las moléculas pequeñas tales como colorantes y los inhibidores de, y de alta resolución de imágenes en vivo de orgánulos de transporte se pueden realizar en las neuronas a temperatura ambiente. Usando Drosophila con diferentes antecedentes genéticos, podemos examinar la función de genes en las neuronas primarias por nocaut (mutaciones genéticas de pérdida de la función), caída (inyección de dsRNA o expresión) o la expresión ectópica (moscas transgénicas). En concreto, la fragmentación de los filamentos de actina utilizando tratamiento CytoD no impide el crecimiento de neuritas, sino que crecen más rápido, y por lo tanto podemos estudiar microtúbulos Dependeorgánulos de transporte NT en las neuronas tratadas con CytoD sin la influencia de los filamentos de actina 11. Por lo tanto, los cultivos primarios de neuronas combinan las ventajas de las células de cultivo de tejidos y vuelan genética, lo que hace que sea un gran sistema para estudiar el transporte de carga en un sistema fisiológico relevante 10,12. Dado que algunas enfermedades neurodegenerativas familiares podrían ser causados ​​por o asociados con defectos de transporte de carga (por ejemplo, la enfermedad de Parkinson 13, la enfermedad de Huntington 14, la enfermedad de Alzheimer 15,16, la esclerosis lateral amiotrófica / ALS 17, síndrome HMN7B y Perry 18,19 y el tipo de ataxia espinocerebelosa 5/SCA5 20), cultivos primarios de neuronas pueden ser útiles en el análisis de los efectos de las mutaciones específicas que causan estas enfermedades en el transporte dependiente de microtúbulos. Por último, las propiedades importantes de transporte dependiente de microtúbulos están bien conservadas entre los mamíferos y las moscas, pero <em&gt; Cultura genética y de células de Drosophila es menos costoso y consume mucho tiempo, lo que justifica el uso de células de Drosophila cultivadas para estudiar los aspectos esenciales de orgánulos de transporte en condiciones normales y patológicas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="435">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:124px;">Powder Insect cell medium (Schneider&#8217;s)</td>
			<td style="width:133px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:179px;">S9895</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:124px;">Insect &#8211;Xpress medium</td>
			<td style="width:133px;">Fisher</td>
			<td style="width:179px;">BW12730Q</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:124px;">Insulin</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:179px;">I6634</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:124px;">Penicillin</td>
			<td style="width:133px;">Research Products International</td>
			<td style="width:179px;">P93000</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:124px;">Streptomycin</td>
			<td style="width:133px;">Research Products International</td>
			<td style="width:179px;">S62000</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:124px;">Tetracycline hydrochloride</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:179px;">T7660-5G</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:124px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:133px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:179px;">S11150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:124px;">Concanavalin A</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:179px;">C2010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:124px;">Cytochalasin D</td>
			<td style="width:133px;">VWR</td>
			<td style="width:179px;">IC15077105</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:124px;">LysoTracker Red DND-99</td>
			<td style="width:133px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:179px;">L7528</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:124px;">100 &#181;m Cell strainer</td>
			<td style="width:133px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:179px;">22363549</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:124px;">25 mm Circle cover glass</td>
			<td style="width:133px;">VWR</td>
			<td style="width:179px;">48380 080</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:124px;">Drosophila Vials</td>
			<td style="width:133px;">VWR</td>
			<td style="width:179px;">89092-730</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:124px;">Disposable pellet pestles with matching microtubes</td>
			<td style="width:133px;">Kimble Chase</td>
			<td style="width:179px;">749520-0000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organelle transport in cultured drosophila cells: s2 cell line and primary neurons.

Células S2 de Drosophila sembraron en un cubreobjetos en la presencia de cualquier largos procesos no ramificados forma de fármaco actina-despolimerización de microtúbulos llenas de manera uniforme polarizadas. Orgánulos se mueven a lo largo de estos procesos a través de los motores de microtúbulos. Fácil mantenimiento, alta sensibilidad a la proteína mediada por RNAi knock-down y un procedimiento eficaz para la creación de líneas celulares estables que hacen las células S2 de Drosophila un sistema modelo ideal para estudiar el transporte de carga por la imagen en vivo. Los resultados obtenidos con las células S2 se pueden aplicar además a un fisiológicamente más relevantes del sistema: el transporte axonal en las neuronas primarias cultivadas a partir de embriones de Drosophila disociadas. Neuronas cultivadas crecen neuritas largas llenas de microtúbulos agrupados, muy similares a los procesos de S2. Al igual que en las células S2, orgánulos en neuronas cultivadas pueden ser visualizados por cualquiera de los tintes fluorescentes-orgánulo específico o mediante el uso de marcadores de orgánulos fluorescentes codificadas por ADN inyectado en embriones tempranos o expresado en transgenic vuela. Por lo tanto, el transporte de orgánulos se puede grabar fácilmente en neuronas cultivadas en cubreobjetos de vidrio utilizando imágenes viviente. Aquí se describen los procedimientos para el cultivo y la visualización de transporte de carga en las células S2 de Drosophila y neuronas primarias. Creemos que estos protocolos hacen ambos sistemas accesibles para los laboratorios que estudian el transporte de carga.

Células Drosophila S2 adjunta en la propagación cubreobjetos recubiertos de ConA en un plano y redondo en forma de &quot;panqueque&quot; (Figuras 1A y 1C). Sin embargo, cuando las células S2 sembraron en cubreobjetos en la presencia de CytoD y permitir que se extienda durante 2-3 h, forman procesos largos y delgados ocupados por los microtúbulos paralelos (Figuras 1B y 1D). Estos microtúbulos tienen polaridad uniforme con plus-termina a <s...

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Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Células S2 de Drosophila y neuronas cultivadas son grandes sistemas de obtención de imágenes de orgánulos de transporte con motor in vivo. Aquí se describen los protocolos detallados para el cultivo de ambos tipos de células, su imagen y el análisis de los transportes.

Orgánulos Transporte en Cultivadas<em&gt; Drosophila</em&gt; Celdas: S2 Línea Celular y neuronas primarias.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Research

JoVE Journal

Biology

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

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La medición de la exocitosis en las neuronas de un etiquetado FM

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

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Biología

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Cultivos neuronales primarios del cerebro de Drosophila pupas etapa tardía

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Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

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Preparación de Drosophila Células S2 para microscopía de luz

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The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Generación de un &quot;humanizado&quot;<em&gt; Drosophila</em&gt; S2 Línea Celular Sensible a farmacológico Inhibición de la Kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Una interfaz gráfica de usuario para el seguimiento asistido por software de la concentración de proteínas en protones dinámicos celulares

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Medición de la Absorción de Glucosa y Respuesta a la Estimulación de la Insulina en<em&gt; In Vitro</em&gt; Myotubes primario humano cultivado

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...