Name: covalent binding of bmp-2 on surfaces using a self-assembled monolayer approach
Uploaded: 2013-08-26T13:00:00
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Nous remercions le Professeur JP Spatz (Département de chimie biophysique de l&#39;Université de Heidelberg et du ministère des nouveaux matériaux et des biosystèmes, Institut Max Planck pour les systèmes intelligents, Stuttgart) pour son soutien en nature. Le soutien financier de la Max-Planck-Gesellschaft et la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB/TR79 à EAC-A.) Sont également très reconnu.

Une. Synthèse de 11-Mercaptoundecanoyl-N-hydroxysuccinimide ester (NHS-MU) <ol><li> Ajouter goutte à goutte une solution de 500 mg de N-hydroxysuccinimide et 30 mg de 4 - (diméthylamino) pyridine dans 10 ml d&#39;acétone (PA) pour 1 g d&#39;acide 11-mercaptoundécanoïque dans 40 ml de dichlorométhane (pa) à la température ambiante (RT). </li><li> Refroidir la réaction à 0 ° C et ajouter goutte à goutte 1,1 g de N, N &#39;-dicyclohexylcarbodiimide dans 10 ml de dichlorométhane (s...

<ol>
	<li>Helm, G., Andersson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Summary+statement:+Bone+morphogenetic+proteins:+Basic+science.">Summary statement: Bone morphogenetic proteins: Basic science.</a> Spine. 27 (16S), S9 (2002).</li><li>Hogan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+proteins:+multifunctional+regulators+of+vertebrate+development.">Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development.</a> Genes Dev. 10 (13), 1580-1594 (1996).</li><li>Reddi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPs:+from+bone+morphogenetic+proteins+to+body+morphogenetic+proteins.">BMPs: from bone morphogenetic proteins to body morphogenetic proteins.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 16, 249-250 (2005).</li><li>Rengachary, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+proteins:+basic+concepts.">Bone morphogenetic proteins: basic concepts.</a> Neurosurg Focus. 13 (6), 1-6 (2002).</li><li>Schlunegger, M., Gru&#776;tter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusual+feature+revealed+by+the+crystal+structure+at+2.2+&#197;;+resolution+of+human+transforming+growth+factor-&#946;2.">An unusual feature revealed by the crystal structure at 2.2 &#197;; resolution of human transforming growth factor-&#946;2.</a> Nature. 358, 430-434 (1992).</li><li>Scheufler, C., Sebald, W., Hu&#776;lsmeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+human+bone+morphogenetic+protein-2+at+2.7+&#197;+resolution.">Crystal structure of human bone morphogenetic protein-2 at 2.7 &#197; resolution.</a> J. 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M., Boergermann, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+immobilization+of+bone+morphogenetic+protein+2+via+a+self-assembled+monolayer+formation+induces+cell+differentiation.">Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation.</a> Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).</li><li>Love, J., Estroff, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+monolayers+of+thiolates+on+metals+as+a+form+of+nanotechnology.">Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology.</a> Chem. 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J., Hou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+systems+for+bone+growth+factors+-+the+new+players+in+skeletal+regeneration.">Delivery systems for bone growth factors - the new players in skeletal regeneration.</a> J. Pharm. Pharmacol. 56 (4), 415-427 (2004).</li><li>Masters, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+growth+factor+immobilization+strategies+for+tissue+repair+and+regeneration.">Covalent growth factor immobilization strategies for tissue repair and regeneration.</a> Macromol. 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Mater. 23 (12), H111-H118 (2011).</li><li>Ruppert, R., Hoffmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+bone+morphogenetic+protein+2+contains+a+heparin-binding+site+which+modifies+its+biological+activity.">Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifies its biological activity.</a> European Journal of Biochemistry. 237 (1), 295-302 (1996).</li><li>Love, J., Estroff, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+monolayers+of+thiolates+on+metals+as+a+form+of+nanotechnology.">Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology.</a> Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).</li><li>Kato, K., Sato, H., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+of+histidine-tagged+recombinant+proteins+onto+micropatterned+surfaces+for+cell-based+functional+assays.">Immobilization of histidine-tagged recombinant proteins onto micropatterned surfaces for cell-based functional assays.</a> Langmuir. 21 (16), 7071-7075 (2005).</li><li>Martins, M., Curtin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecularly+designed+surfaces+for+blood+deheparinization+using+an+immobilized+heparin-binding+peptide.">Molecularly designed surfaces for blood deheparinization using an immobilized heparin-binding peptide.</a> J. Biomed. Mater. 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Chem. 21 (10), 1762-1772 (2010).</li><li>Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RGD+modified+polymers:+biomaterials+for+stimulated+cell+adhesion+and+beyond.">RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond.</a> Biomaterials. 24 (24), 4385-4415 (2003).</li><li>Cao, T., Wang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+spacer+length+effect+on+immobilized+Escherichia+coli+pili-antibody+molecular+recognition+by+AFM.">Investigation of spacer length effect on immobilized Escherichia coli pili-antibody molecular recognition by AFM.</a> Biotechnol. Bioeng. 98 (6), 1109-1122 (2007).</li><li>Puleo, D., Kissling, R., Sheu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+technique+to+immobilize+bioactive+proteins,+including+bone+morphogenetic+protein-4+(BMP-4),+on+titanium+alloy.">A technique to immobilize bioactive proteins, including bone morphogenetic protein-4 (BMP-4), on titanium alloy.</a> Biomaterials. 23 (9), 2079-2087 (2002).</li></ol>

Dans ce protocole, nous décrivons la préparation de surfaces fonctionnalisées avec bioactif rhBMP-2. Cette approche comporte deux étapes: 1) la formation initiale d&#39;une monocouche d&#39;auto-assemblage (SAM) d&#39;un groupe de liaison bifonctionnel sur la surface d&#39;or, 2) l&#39;immobilisation covalente de la protéine de rhBMP-2. Dans des travaux antérieurs, nous avons validé la liaison efficace de l&#39;agent de liaison bifonctionnel, et le facteur de croissance, et démontré que la surface immobilisée ...

Une protéine morphogénétique osseuse 2 (BMP-2) est un élément du facteur de croissance transformant (TGF-β) de la famille et agit comme inducteur de la formation de novo de l&#39;os ainsi que la régulation de plusieurs tissus au cours du développement embryonnaire et adulte homéostasie 3.1. Chaque monomère de l&#39;homodimère protéine biologiquement active BMP-2 contient un motif &quot;cysteine ​​de noeud&quot;, qui est hautement conservée dans toutes les PGB 4. Six des sept résidus de cysteine ​​forment des ponts disulfure intramoléculaires qui stabilisent chaque monomère, tandis que le septième cysteine ​​est impliquée dans la dimérisation, la formation d&#39;une liaison intermoléculaire entre les deux monomères 5,6. Ce nœud de cysteine ​​hautement conservés définit la structure tridimensionnelle de la protéine BMP-2 et détermine ses propriétés uniques, telles que résistance à la chaleur, et des dénaturants acide pH 7-9. BMP-2 se lie à la sérine / thréonine kinase des récepteurs transmembranaires, ce qui induit une transduction de signal <sup&gt; 10 à 12. Selon le mode d&#39;oligomérisation du récepteur, différentes voies de signalisation sont activés: une cascade de signalisation Smad-indépendante mène à la phosphatase alcaline de l&#39;induction par l&#39;intermédiaire de la signalisation de p38, tandis qu&#39;une voie de Smad-dépendant activé par les résultats de la phosphorylation du récepteur à Smad translocation nucléaire complexe et l&#39;activation de la transcription d&#39; gènes cibles spécifiques, tels que l&#39;inhibiteur de la différenciation (Id) de 12 à 14. Dans l&#39;os, la BMP-2 induit la différenciation des cellules souches mésenchymateuses en ostéoblastes, stimulant ainsi la guérison et la formation de novo de l&#39;os. Actuellement, exprimée par recombinaison BMP-2 est appliqué en clinique pour améliorer la guérison des sites fracturés. Une stratégie courante dans l&#39;ingénierie tissulaire osseuse est l&#39;utilisation de facteurs de croissance injectables, ce qui est moins invasive par rapport aux systèmes d&#39;administration locale. Cependant, des études in vivo et des applications cliniques ont montré que la demi-vie biologique courte, loc non spécifiquelisation et domiciliation rapide de BMP-2 peut conduire à plusieurs problèmes locaux, ectopiques et systémiques 15. Par conséquent, pour obtenir une présentation efficace, le piégeage ou l&#39;immobilisation de la BMP-2 à l&#39;intérieur ou sur des matériaux est nécessaire pour sa délivrance locale et prolongée au niveau du site cible. Une distribution prolongée peut être obtenue avec des approches de rétention de non-covalentes, telles que le piégeage physique, l&#39;adsorption ou la complexation d&#39;ions 16. Cependant, il est connu que l&#39;adsorption non spécifique de protéines sur les surfaces peut élément de dénaturation des molécules 17. Pour la liaison des facteurs de croissance covalente, différents types de supports ont été développés au cours de la dernière décennie. L&#39;utilisation de molécules de liaison bifonctionnels qui ciblent des groupes amino ou carboxyle de la protéine, par exemple, est un type d&#39;approche qui ne nécessite pas nécessairement une modification de la protéine pour obtenir son immobilisation. En fait, tandis que la modification des protéines offre l&#39;avantage de contrôler l&#39;orientation de la protéine,l&#39;introduction de domaines artificiels, des étiquettes et des chaînes peptidiques spécifiques à un site peut modifier l&#39;activité biologique de facteurs de croissance 17. Ainsi, pour contourner la dénaturation due à l&#39;interaction avec le matériau de support, les surfaces peuvent être fonctionnalisés à l&#39;avance, par exemple, avec une monocouche auto-assemblée (SAM) d&#39;une molécule de liaison, suivie d&#39;un couplage du facteur désiré 18. Nous avons utilisé une approche fondée sur les SAM pour immobiliser de manière covalente BMP-2 sur une surface en ciblant ses résidus aminés libres et avons montré que la protéine immobilisée conserve à la fois son activité biologique à court et à long terme 19. Ce protocole offre un moyen simple et efficace pour délivrer la BMP-2 dans des cellules pour des études in vitro sur les mécanismes qui se produisent à la membrane cellulaire et régulent la signalisation intracellulaire responsable de la signalisation ostéogénique.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-hydroxysuccinimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>130672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(dimethylamino)pyridin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>522805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11-mercaptoundecanoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>674427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichlormethane</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;-dicyclohexylcarbodiimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D80002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum benzene</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>M 875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylacetate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-dimethylformamide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhBMP-2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>355-BM</td>
			<td>Carrier-free; expressed in E.coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>H15-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HN00.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(dimethyl siloxane) (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rhBMP-2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG-HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampliflu Red assay</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>90101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966</td>
			<td>High glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td>Sterile filtered, cell culture tested</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05% (1x) with EDTA 4Na</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine (0.1 M)</td>
			<td>Riedel-de Ha&#235;n</td>
			<td>33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630 (1%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td>Lysis buffer (ALP assay)19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)(1 mM)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HNO3.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride (ZnCl2) (1 mM)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3533.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-nitrophenylphosphate (pNPP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0942</td>
			<td>Phosphatase substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mysin heavy chain (MHC)</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa</td>
			<td>MF20</td>
			<td>Monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrsonic bath (Sonorex Super RK 102H), Frequency 35 kHz</td>
			<td>BANDELIN electronic GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MED 020 Sputtercoating system</td>
			<td>BAL-TEC AG</td>
			<td></td>
			<td>Coating conditions 
			Cr: 120 mA, 1.3 x 10-2 mbar, 30 sec 
			Au: 60 mA, 5.0 x 10-2 mbar, 45 sec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite M200 Plate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

covalent binding of bmp-2 on surfaces using a self-assembled monolayer approach

la protéine morphogénétique osseuse 2 (BMP-2) est un facteur de croissance incorporé dans la matrice extracellulaire du tissu osseux. BMP-2 agit comme déclencheur de la différenciation des cellules mésenchymateuses en ostéoblastes, stimulant ainsi la guérison et la formation osseuse de novo. L&#39;utilisation clinique de l&#39;humain recombinant BMP-2 (rhBMP-2), en liaison avec des échafaudages a soulevé controverses récentes, sur la base du mode de présentation et la quantité à délivrer. Le protocole présenté ici fournit un moyen simple et efficace pour délivrer la BMP-2 pour des études in vitro sur des cellules. Nous décrivons comment former une monocouche auto-assemblée constituée d&#39;un segment de liaison hétérobifonctionnel, et on montre l&#39;étape ultérieure de liaison pour obtenir une immobilisation covalente de rhBMP-2. Avec cette approche, il est possible d&#39;obtenir une présentation prolongée de la BMP-2, tout en maintenant l&#39;activité biologique de la protéine. En fait, l&#39;immobilisation de la surface de la BMP-2 permet enquêtes ciblées en empêchant annonces non spécifiquesorption, tout en réduisant la quantité de facteur de croissance et, plus particulièrement, ce qui empêche la libération non contrôlée de la surface. Les deux à court et à long terme des événements de signalisation déclenchées par BMP-2 ont lieu lorsque les cellules sont exposées à des surfaces présentant immobilisé de manière covalente rhBMP-2, ce qui rend cette approche appropriée pour des études in vitro sur les réponses cellulaires à la BMP-2 stimulation.

Dans notre configuration, l&#39;or a été choisi comme excipient car il fournit un système biologique non spécifique mais chimiquement accordable. En outre, l&#39;application de monocouches auto-assemblage comporte de nombreux avantages: SAM adsorber spontanément par leurs «tête-groupes&quot; sur les métaux et forment des monocouches avec quelques défauts, tandis que leurs groupes terminaux fonctionnels peuvent encore être modifiés. Ainsi, ils fournissent une plateforme pour adapter les propriétés de l&#39;i...

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Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach

Nous décrivons un procédé pour réaliser une immobilisation efficace de la BMP-2 sur les surfaces. Notre approche est basée sur la formation d&#39;une monocouche auto-assemblée de réaliser la liaison de BMP-2 par l&#39;intermédiaire de ses résidus amines libres covalente. Cette méthode est un outil utile pour étudier la signalisation à la membrane cellulaire.

Liaison covalente de BMP-2 sur les surfaces en utilisant une approche monocouche auto-assemblée

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is a growth factor embedded in the extracellular matrix of bone tissue. BMP-2 acts as trigger of mesenchymal cell ...

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Dépendance de Laser-induites Répartition spectroscopie Résultats sur les énergies d&#39;impulsions et paramètres de temporisation aide de simulateurs Pédo

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