Name: covalent binding of bmp-2 on surfaces using a self-assembled monolayer approach
Uploaded: 2013-08-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach at JoVE.com

אנו מודים לפרופ &#39;JP פאץ (מחלקה לכימית Biophysical, אוניברסיטת היידלברג ומחלקת לחומרים חדשים וBiosystems, מכון מקס פלאנק למערכות נבונות, שטוטגרט) לתמיכה מהסוג שלו. התמיכה הכספית ממכון מקס פלנק-Gesellschaft וForschungsgemeinschaft דויטשה (DFG SFB/TR79 לEAC-.) גם הם הכירו באופן משמעותי.

1. סינתזה של 11-Mercaptoundecanoyl-N-hydroxysuccinimide אסתר (MU-NHS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת dropwise פתרון של 500 מ&quot;ג N-hydroxysuccinimide ו30 מ&quot;ג 4 - פירידין (dimethylamino) ב10 מיליליטר אצטון (PA) עד 1 גרם חומצת 11-mercaptoundecanoic ב40 מיליליטר dichloromethane (PA) בטמפרטורת חדר (RT). </li><li st...

<ol>
	<li>Helm, G., Andersson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Summary+statement:+Bone+morphogenetic+proteins:+Basic+science.">Summary statement: Bone morphogenetic proteins: Basic science.</a> Spine. 27 (16S), S9 (2002).</li><li>Hogan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+proteins:+multifunctional+regulators+of+vertebrate+development.">Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development.</a> Genes Dev. 10 (13), 1580-1594 (1996).</li><li>Reddi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPs:+from+bone+morphogenetic+proteins+to+body+morphogenetic+proteins.">BMPs: from bone morphogenetic proteins to body morphogenetic proteins.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 16, 249-250 (2005).</li><li>Rengachary, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+proteins:+basic+concepts.">Bone morphogenetic proteins: basic concepts.</a> Neurosurg Focus. 13 (6), 1-6 (2002).</li><li>Schlunegger, M., Gru&#776;tter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusual+feature+revealed+by+the+crystal+structure+at+2.2+&#197;;+resolution+of+human+transforming+growth+factor-&#946;2.">An unusual feature revealed by the crystal structure at 2.2 &#197;; resolution of human transforming growth factor-&#946;2.</a> Nature. 358, 430-434 (1992).</li><li>Scheufler, C., Sebald, W., Hu&#776;lsmeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+human+bone+morphogenetic+protein-2+at+2.7+&#197;+resolution.">Crystal structure of human bone morphogenetic protein-2 at 2.7 &#197; resolution.</a> J. Mol. Biol. 287 (1), 103-115 (1999).</li><li>Nimni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polypeptide+growth+factors:+targeted+delivery+systems.">Polypeptide growth factors: targeted delivery systems.</a> Biomaterials. 18 (18), 1201-1225 (1997).</li><li>Wozney, J., Rosen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+protein+and+bone+morphogenetic+protein+gene+family+in+bone+formation+and+repair.">Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair.</a> Clin. Orthop. Related Res. 346, 26 (1998).</li><li>Rosen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+and+BMP+inhibitors+in+bone.">BMP and BMP inhibitors in bone.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 19-25 (2006).</li><li>Kirsch, T., Sebald, W., Dreyer, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+BMP-2-BRIA+ectodomain+complex.">Crystal structure of the BMP-2-BRIA ectodomain complex.</a> Nat. Struct. Biol. 7 (6), 492-496 (2000).</li><li>Keller, S., Nickel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+recognition+of+BMP-2+and+BMP+receptor+IA.">Molecular recognition of BMP-2 and BMP receptor IA.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (5), 481-488 (2004).</li><li>Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+receptor+signaling:+transcriptional+targets,+regulation+of+signals,+and+signaling+cross-talk.">BMP receptor signaling: transcriptional targets, regulation of signals, and signaling cross-talk.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 16 (3), 251-263 (2005).</li><li>Nohe, A., Hassel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mode+of+bone+morphogenetic+protein+(BMP)+receptor+oligomerization+determines+different+BMP-2+signaling+pathways.">The mode of bone morphogenetic protein (BMP) receptor oligomerization determines different BMP-2 signaling pathways.</a> J. Biol. Chem. 277 (7), 5330-5338 (2002).</li><li>Sieber, C., Kopf, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+BMP+receptor+signaling.">Recent advances in BMP receptor signaling.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 343-355 (2009).</li><li>Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+review+of+recombinant+human+bone+morphogenetic+protein-2+trials+in+spinal+surgery:+emerging+safety+concerns+and+lessons+learned.">A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned.</a> Spine J. 11, 471-491 (2011).</li><li>Luginbuehl, V., Meinel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+delivery+of+growth+factors+for+bone+repair.">Localized delivery of growth factors for bone repair.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 197-208 (2004).</li><li>Nakaji-Hirabayashi, T., Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oriented+immobilization+of+epidermal+growth+factor+onto+culture+substrates+for+the+selective+expansion+of+neural+stem+cells.">Oriented immobilization of epidermal growth factor onto culture substrates for the selective expansion of neural stem cells.</a> Biomaterials. 28 (24), 3517-3529 (2007).</li><li>Gon&#231;alves, R., Martins, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactivity+of+immobilized+EGF+on+self-assembled+monolayers:+Optimization+of+the+immobilization+process.">Bioactivity of immobilized EGF on self-assembled monolayers: Optimization of the immobilization process.</a> J. Biomed. Mater. Res. Part A. 94A. 2 (2), 576-585 (2010).</li><li>Pohl, T. L. M., Boergermann, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+immobilization+of+bone+morphogenetic+protein+2+via+a+self-assembled+monolayer+formation+induces+cell+differentiation.">Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation.</a> Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).</li><li>Love, J., Estroff, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+monolayers+of+thiolates+on+metals+as+a+form+of+nanotechnology.">Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology.</a> Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).</li><li>Katagiri, T., Yamaguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+protein-2+converts+the+differentiation+pathway+of+C2C12+myoblasts+into+the+osteoblast+lineage.">Bone morphogenetic protein-2 converts the differentiation pathway of C2C12 myoblasts into the osteoblast lineage.</a> J. Cell Biol. 127 (6), 1755-1766 (1994).</li><li>Whitaker, M. J., Quirk, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factor+release+from+tissue+engineering+scaffolds.">Growth factor release from tissue engineering scaffolds.</a> J. Pharm. Pharmacol. 53 (11), 1427-1437 (2001).</li><li>Uludag, H., D'Augusta, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implantation+of+recombinant+human+bone+morphogenetic+proteins+with+biomaterial+carriers:+a+correlation+between+protein+pharmacokinetics+and+osteoinduction+in+the+rat+ectopic+model.">Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: a correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model.</a> J. Biomed. Mater. Res. 50 (2), 227-238 (2000).</li><li>Kashiwagi, K., Tsuji, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+BMP-2+for+functionalization+of+titanium+surfaces.">Directional BMP-2 for functionalization of titanium surfaces.</a> Biomaterials. 30 (6), 1166-1175 (2008).</li><li>Karageorgiou, V., Meinel, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+protein-2+decorated+silk+fibroin+films+induce+osteogenic+differentiation+of+human+bone+marrow+stromal+cells.">Bone morphogenetic protein-2 decorated silk fibroin films induce osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells.</a> J. Biomed. Mater. Res. 71 (3), 528-573 (2004).</li><li>Rose, F. R. A. J., Hou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+systems+for+bone+growth+factors+-+the+new+players+in+skeletal+regeneration.">Delivery systems for bone growth factors - the new players in skeletal regeneration.</a> J. Pharm. Pharmacol. 56 (4), 415-427 (2004).</li><li>Masters, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+growth+factor+immobilization+strategies+for+tissue+repair+and+regeneration.">Covalent growth factor immobilization strategies for tissue repair and regeneration.</a> Macromol. Biosci. 11 (9), 1149-1163 (2011).</li><li>Crouzier, T., Fourel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presentation+of+BMP-2+from+a+soft+biopolymeric+film+unveils+its+activity+on+cell+adhesion+and+migration.">Presentation of BMP-2 from a soft biopolymeric film unveils its activity on cell adhesion and migration.</a> Adv. Mater. 23 (12), H111-H118 (2011).</li><li>Ruppert, R., Hoffmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+bone+morphogenetic+protein+2+contains+a+heparin-binding+site+which+modifies+its+biological+activity.">Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifies its biological activity.</a> European Journal of Biochemistry. 237 (1), 295-302 (1996).</li><li>Love, J., Estroff, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+monolayers+of+thiolates+on+metals+as+a+form+of+nanotechnology.">Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology.</a> Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).</li><li>Kato, K., Sato, H., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+of+histidine-tagged+recombinant+proteins+onto+micropatterned+surfaces+for+cell-based+functional+assays.">Immobilization of histidine-tagged recombinant proteins onto micropatterned surfaces for cell-based functional assays.</a> Langmuir. 21 (16), 7071-7075 (2005).</li><li>Martins, M., Curtin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecularly+designed+surfaces+for+blood+deheparinization+using+an+immobilized+heparin-binding+peptide.">Molecularly designed surfaces for blood deheparinization using an immobilized heparin-binding peptide.</a> J. Biomed. Mater. Res. 88 (1), 162-173 (2009).</li><li>Limbut, W., Kanatharana, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+capacitive+immunosensors+based+on+self-assembled+monolayers+formed+from+thiourea,+thioctic+acid,+and+3-+mercaptopropionic+acid.">A comparative study of capacitive immunosensors based on self-assembled monolayers formed from thiourea, thioctic acid, and 3- mercaptopropionic acid.</a> Biosens. Bioelectron. 22 (2), 233-240 (2006).</li><li>Patel, N., Davies, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+of+protein+molecules+onto+homogeneous+and+mixed+carboxylate-terminated+self-assembled+monolayers.">Immobilization of protein molecules onto homogeneous and mixed carboxylate-terminated self-assembled monolayers.</a> Langmuir. 13 (24), 6485-6490 (1997).</li><li>Hu, J., Duppatla, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+PEGylation+of+bone+morphogenetic+protein-2+cysteine+analogues.">Site-specific PEGylation of bone morphogenetic protein-2 cysteine analogues.</a> Bioconjug. Chem. 21 (10), 1762-1772 (2010).</li><li>Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RGD+modified+polymers:+biomaterials+for+stimulated+cell+adhesion+and+beyond.">RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond.</a> Biomaterials. 24 (24), 4385-4415 (2003).</li><li>Cao, T., Wang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+spacer+length+effect+on+immobilized+Escherichia+coli+pili-antibody+molecular+recognition+by+AFM.">Investigation of spacer length effect on immobilized Escherichia coli pili-antibody molecular recognition by AFM.</a> Biotechnol. Bioeng. 98 (6), 1109-1122 (2007).</li><li>Puleo, D., Kissling, R., Sheu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+technique+to+immobilize+bioactive+proteins,+including+bone+morphogenetic+protein-4+(BMP-4),+on+titanium+alloy.">A technique to immobilize bioactive proteins, including bone morphogenetic protein-4 (BMP-4), on titanium alloy.</a> Biomaterials. 23 (9), 2079-2087 (2002).</li></ol>

בפרוטוקול זה אנו מתארים את הכנת המשטחים פונקציונליות עם rhBMP-2 ביו. גישה זו כוללת שני שלבים: 1) היווצרות הראשונית של monolayer הרכבה עצמית (SAM) של מקשר bifunctional על משטח הזהב, 2) קיבוע קוולנטי של חלבון rhBMP-2. בעבודה קודמת, שתוקפים יעיל מחייב של מקשר bifunctional וגורם הגדילה, והוכחתי כי מש?...

חלבון morphogenetic עצם 2 (BMP-2) הוא חבר של גורם הפיכת צמיחת משפחה (TGF-β) ופועל כמשדל של דה נובו היווצרות עצם כמו גם רגולטור של כמה רקמות במהלך התפתחות עוברית ובוגר הומאוסטזיס 1-3. כל מונומר של BMP-2 החלבון homodimeric הפעיל הביולוגית מכיל מוטיב &quot;קשר ציסטאין&quot;, שזה שמור ביותר בכל 4 BMPs. שש משאריות ציסטאין שבע ליצור קשרי דיסולפיד intramolecular כי לייצב מונומר אחד, ואילו ציסטאין השביעי מעורבים בdimerization, ויצר אג&quot;ח מולקולאריים בין שני מונומרים 5,6. קשר ציסטאין השמור ביותר זה מגדיר את המבנה התל הממדי של חלבון BMP-2 וקובע את המאפיינים הייחודיים שלה, כגון עמידות מפני חום, denaturants וחומצי pH 7-9. BMP-2 נקשר לקולטנים הטרנסממברני קינאז סרין / תראונין, וכך גרימת הולכות אותות <sup&gt; 10-12. בהתאם למצב של oligomerization קולט, מסלולי איתות שונים מופעלים: מפל איתות הסמאד עצמאי מוביל לאינדוקצית phosphatase אלקליין באמצעות איתות p38, ואילו מסלול הסמאד תלוי מופעל על ידי תוצאות זרחון הקולטן בטרנסלוקציה הסמאד המורכבת גרעינית והפעלה של שעתוק של גנים ספציפיים יעד, כגון המעכב של התמיינות (Id) 12-14. בעצמות, BMP-2 גורם להתמיינות של תאי גזע mesenchymal לאוסטאובלסטים, וכך מגרה את הריפוי והיווצרות דה נובו של עצם. נכון לעכשיו, recombinantly הביע BMP-2 מוחל קליני כדי לשפר את הריפוי של אתרים שבורים. אסטרטגיה נפוצה בהנדסת רקמות עצם היא השימוש בגורמי גדילה בזריקות, שהוא פחות פולשני בהשוואה למערכות אספקה ​​מקומיות. עם זאת, במחקרי vivo ויישומים קליניים הראו כי זמן מחצית החיים הביולוגיים קצרים, loc הנוקבalization וסליקה מקומית מהירה של BMP-2 עשויים להוביל למספר בעיות מקומיות, מחוץ לרחם ומערכתית 15. לפיכך, כדי להשיג מצגת יעילה, המלכוד או חוסר תנועה של BMP-2 בתוך או על גבי חומרים הכרחי למסירה באתר היעד מתמשכת והמקומית שלה. משלוח מתמשך ניתן להשיג עם גישות שימור שאינו קוולנטיים, כגון הילכדות פיזית, ספיחה או complexation יון 16. עם זאת, ידוע כי ספיחה לא ספציפית של חלבונים על משטחים עשויות תוצאות בdenaturation של המולקולות 17. לקוולנטיים המחייב של גורמי גדילה, סוגים שונים של תומך פותחו בעשור האחרון. השימוש במולקולות מקשרים bifunctional כי יעד קבוצות אמינו או carboxyl של החלבון לדוגמא, הוא סוג אחד גישה שלא בהכרח דורש שינוי חלבון כדי להשיג קיבועה של. למעשה, בעוד שינוי החלבון מציע את היתרון של השליטה נטייה חלבון,המבוא של תחומים מלאכותיים, תגי פפטיד ורשתות באתר ספציפי עשוי לשנות את הפעילות הביולוגית של גידול גורמי 17. לכן, כדי לעקוף denaturation עקב אינטראקציה עם חומר התמיכה, יכולים להיות פונקציונליות משטחים מראש, למשל, עם monolayer עצמי התאספו (SAM) של מולקולה המקשרת, ואחריו צימוד של הגורם הרצוי 18. יש לנו בשימוש בגישה מבוססת SAM כדי לשתק קוולנטית BMP-2 על גבי משטח על ידי מיקוד השאריות האמינים בחינם והראינו כי החלבון המשותק שומר גם הפעילות הביולוגית לטווח קצר והארוך שלה 19. פרוטוקול זה מספק דרך פשוטה ויעילה כדי לספק BMP-2 לתאים לבדיקות במבחנה על המנגנונים שמתרחשים בקרום התא ומווסתים את האיתות תאית אחראית לאיתות osteogenic.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-hydroxysuccinimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>130672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(dimethylamino)pyridin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>522805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11-mercaptoundecanoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>674427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichlormethane</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;-dicyclohexylcarbodiimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D80002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum benzene</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>M 875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylacetate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-dimethylformamide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhBMP-2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>355-BM</td>
			<td>Carrier-free; expressed in E.coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>H15-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HN00.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(dimethyl siloxane) (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rhBMP-2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG-HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampliflu Red assay</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>90101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966</td>
			<td>High glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td>Sterile filtered, cell culture tested</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05% (1x) with EDTA 4Na</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine (0.1 M)</td>
			<td>Riedel-de Ha&#235;n</td>
			<td>33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630 (1%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td>Lysis buffer (ALP assay)19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)(1 mM)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HNO3.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride (ZnCl2) (1 mM)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3533.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-nitrophenylphosphate (pNPP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0942</td>
			<td>Phosphatase substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mysin heavy chain (MHC)</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa</td>
			<td>MF20</td>
			<td>Monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrsonic bath (Sonorex Super RK 102H), Frequency 35 kHz</td>
			<td>BANDELIN electronic GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MED 020 Sputtercoating system</td>
			<td>BAL-TEC AG</td>
			<td></td>
			<td>Coating conditions 
			Cr: 120 mA, 1.3 x 10-2 mbar, 30 sec 
			Au: 60 mA, 5.0 x 10-2 mbar, 45 sec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite M200 Plate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

covalent binding of bmp-2 on surfaces using a self-assembled monolayer approach

morphogenetic עצם חלבון 2 (BMP-2) הוא גורם גדילה משובץ במטריצה ​​תאית של רקמת עצם. BMP-2 משמש כהדק של התמיינות תאי mesenchymal לאוסטאובלסטים, וכך מגרה ריפוי והיווצרות עצם נובו דה. השימוש הקליני של אנושי רקומביננטי BMP-2 (rhBMP-2) בשיתוף עם פיגומים העלה מחלוקות האחרונות, המבוסס על המצב של מצגת ואת הסכום כדי להיות מועבר. הפרוטוקול המובא כאן מספק דרך פשוטה ויעילה כדי לספק BMP-2 לבדיקות במבחנה בתאים. אנו מתארים כיצד ליצור monolayer עצמית התאספו בהיקף של מקשר heterobifunctional, ולהראות את הצעד מחייב שלאחר מכן כדי להשיג קיבוע קוולנטי של rhBMP-2. עם גישה זו אפשר להשיג מצגת מתמשכת של BMP-2 תוך שמירה על הפעילות הביולוגית של החלבונים. למעשה, חוסר התנועה של BMP-2 המשטח מאפשרת חקירות ממוקדות על ידי מניעת מודעות נוקבותorption, תוך הפחתת הכמות של גורם גדילה, ובעיקר, פוגע בשחרור מבוקר מהשטח. שני אירועי האיתות לטווח קצר וארוך מופעלים על ידי BMP-2 מתרחשים כאשר תאים נחשפים למשטחי הצגה משותקים קוולנטית rhBMP-2, מה שהופך את הגישה הזאת מתאימה למחקרים במבחנה בתגובות תא לBMP-2 גירוי.

בהתקנה שלנו, זהב נבחר כחומר לא פעיל מאז שהיא מספקת מערכת ביולוגית נוקבת אבל כימי מתכונן. יתר על כן, היישום של monolayers הרכבה העצמית כרוך יתרונות רבים: סאמס לספוג באופן ספונטני באמצעות &quot;ראש הקבוצות&quot; שלהם על מתכות וmonolayers טופס עם כמה פגמים, ואילו ניתן לשנות קצה הקבוצות ?...

Watch this Scientific Journal Video about Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach at JoVE.com

Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach

אנו מתארים שיטה לביצוע קיבוע יעיל של BMP-2 על גבי משטחים. הגישה שלנו מבוססת על היווצרות monolayer עצמי התאספו כדי להשיג את הקשר הקוולנטי של BMP-2 באמצעות השאריות האמינים שלה בחינם. שיטה זו היא כלי שימושי כדי ללמוד איתות בקרום התא.

קוולנטיים עקידת BMP-2 על משטחים באמצעות גישה חד שכבתי התאסף עצמית

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is a growth factor embedded in the extracellular matrix of bone tissue. BMP-2 acts as trigger of mesenchymal cell ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Organic Chemistry

Chemistry

Unit 1

Covalent Bonding and Structure

SCIENTISTS IN ACTION

Dependence of Laser-induced Breakdown Spectroscopy Results on Pulse Energies and Timing Parameters Using Soil Simulants

תלות של תוצאות ספקטרוסקופיה ההתפלגות מושרה לייזר על אנרגיות דופק ופרמטרים תזמון שימוש Simulants קרקע

The  dependence of some LIBS detection capabilities on lower pulse energies (&lt;100  mJ) and timing parameters were examined using synthetic silicate ...

Stabilizing Hepatocellular Phenotype Using Optimized Synthetic Surfaces

ייצוב Hepatocellular הפנוטיפ באמצעות משטחים סינטטיים אופטימליים

Currently, one of the major limitations in cell biology is maintaining differentiated cell phenotype. Biological matrices are commonly used for culturing ...

An Inverse Analysis Approach to the Characterization of Chemical Transport in Paints

גישה הפוכה ניתוח לאפיון כימי תחבורה בצבעים

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in ...

Dynamic Electrochemical Measurement of Chloride Ions

מדידת אלקטרוכימיות הדינמית של יוני כלוריד

This protocol describes the dynamic measurement of chloride ions using the transition time of a silver silver chloride (Ag/AgCl) electrode. Silver silver ...

Facile Preparation of Internally Self-assembled Lipid Particles Stabilized by Carbon Nanotubes

הכנה קלילה של פנימית עצמית התאספו חלקיקים ליפידים מיוצב על ידי פחמן

We present a facile method to prepare nanostructured lipid particles stabilized by carbon nanotubes (CNTs). Single-walled (pristine) and multi-walled ...

Highly Stable, Functional Hairy Nanoparticles and Biopolymers from Wood Fibers: Towards Sustainable Nanotechnology

מאוד יציבים, חלקיקים שעירים פונקציונליים Biopolymers סיבי עץ: לקראת ננוטכנולוגיה קיימא

Nanoparticles, as one of the key materials in nanotechnology and nanomedicine, have gained significant importance during the past decade. While ...

Microfluidic-based Synthesis of Covalent Organic Frameworks (COFs): A Tool for Continuous Production of COF Fibers and Direct Printing on a Surface

Microfluidic-based Synthesis of Covalent Organic Frameworks COFs: A Tool for Continuous Production of COF Fibers and Direct Printing on a Surface

Microfluidic מבוסס סינתזה של מסגרות אורגני קוולנטי (COF): כלי לייצור רציף של סיבים COF והדפסה ישירה על משטח

Covalent Organic Frameworks (COFs) are a class of porous covalent materials which are frequently synthesized as unprocessable crystalline powders. The ...

Light-driven Molecular Motors on Surfaces for Single Molecular Imaging

מונחי-אור המנועים המולקולריים על משטחים עבור יחיד הדמיה מולקולרית

The design and synthesis of a synthetic system that aims for the direct visualization of a synthetic rotary motor at the single molecule level on surfaces ...

Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides

שיטות לקביעת מבנה ומנגנונים של זיהוי יון מתכת וחמצון פעילות של כריכת מתכת Oligopeptides

Electrospray ionization (ESI) can transfer an aqueous-phase peptide or peptide complex to the gas-phase while conserving its mass, overall charge, ...

Synthesis of Information-bearing Peptoids and their Sequence-directed Dynamic Covalent Self-assembly

סינתזה של מידע-מיסב פטואידים והרכבה עצמית בימוי דינמי

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded ...